WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

Pages:   || 2 | 3 |

«РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ ...»

-- [ Страница 1 ] --

1

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

На правах рукописи

ТУРТУЕВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА

РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО

И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

НИКОЛАЕВА ГАЛИНА

ГРИГОРЬЕВНА

Улан-Удэ – 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. РАСТИТЕЛЬНЫЕ 10

НЕЙРОПРОТЕКТОРЫ – ПЕРСПЕКТИВНЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ

ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ.

1.1. Этиология и патогенез цереброваскулярных заболеваний 10

1.2. Лекарственные средства, обладающие нейропротективным действием 13

1.3. Растительные нейропротекторы 16

1.4. Характеристика лекарственного растительного сырья, входящего в 19 состав исходного сбора 1.4.1. Корни астрагала перепончатого 19 1.4.2. Корни шлемника байкальского 25 1.4.3. Корневища и корни вздутоплодника сибирского 33

1.5. Сборы и экстракты сухие – оптимальные формы переработки 38 лекарственного растительного сырья Выводы к главе 1 41

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 42

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42

2.1. Материалы исследования 42

2.2. Методы исследования 42

ГЛАВА 3. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРНЕЙ 52

АСТРАГАЛА ПЕРЕПОНЧАТОГО

3.1. Характеристика морфологических признаков сырья 52

3.2. Характеристика микроскопических признаков сырья 52

3.3. Товароведческий анализ корней астрагала перепончатого 56

3.4. Фитохимическое изучение корней астрагала перепончатого 58 3.4.1. Качественный анализ 58 3.4.2. Идентификация фенольных соединений методом высокоэффективной 60 жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 3.4.3. Обнаружение олеаноловой кислоты методом тонкослойной 63 хроматографии (ТСХ) 3.4.4. Идентификация свободных и связанных аминокислот методом 64 ионообменной хроматографии 3.4.5. Изучение жирных кислот корней астрагала перепончатого 65 3.4.6. Изучение углеводного комплекса корней астрагала перепончатого 66 3.4.7. Определение содержания тритерпеновых сапонинов в корнях 69 астрагала перепончатого

–  –  –

ВВЕДЕНИЕ

Одной из важнейших медико - социальных проблем современной неврологии являются цереброваскулярные заболевания (ЦВЗ), которые характеризуются высокими показателями заболеваемости, смертности и инвалидности практически во всех странах мира [40]. Так, в России ежегодно регистрируют около 400-450 тысяч инсультов, из которых 80-85% имеют ишемический характер [19].
Одним из основных направлений эффективной терапии цереброваскулярных заболеваний признается применение препаратов, обладающих ноотропными и нейропротективными свойствами [93,129]. В этом плане особый интерес представляют лекарственные средства растительного происхождения, биологически активные вещества (БАВ) которых обладают антиоксидантным, гипотензивным, седативным, анксиолитическим, нейромодулирующим и противовоспалительным свойствами [51].

Таким образом, актуальным является проведение фармакогностических работ по созданию растительных средств, обладающих нейропротективным действием. Известными фармакопейными растениями, широко используемыми в лечении и профилактике цереброваскулярных заболеваний, являются корни шлемника байкальского [135, 184], корневища и корни вздутоплодника сибирского [31 - 35]. Кроме того, перспективным растением для терапии ишемических поражений головного мозга является астрагал перепончатый. В настоящее время многочисленными работами зарубежных и отечественных авторов доказано, что корни астрагала перепончатого проявляют кардиопротективный [189] иммуномодулирующий [254], антиоксидантный [203], противоопухолевый [239], противовирусный [208], противовоспалительный [144], противодиабетический [204], нейропротективный [108] и гепатопротекторный эффекты [236]. Но в РФ нет нормативной документации на данный вид растительного сырья, что создает трудности при разработке лекарственных средств на его основе.

В ИОЭБ СО РАН разработана трехкомпонентная растительная композиция указанных выше растений, для которой установлена нейропротективная активность.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является фармакогностическое исследование корней астрагала перепончатого, сбора нейропротективного и разработка экстракта сухого на основе сбора.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

– установить макро- и микроскопические признаки и химический состав корней астрагала перепончатого;

– экспериментально обосновать состав и соотношение компонентов исходного сбора, обладающего нейропротективным действием, и провести его фармакогностическое изучение;

– выявить особенности экстрагирования действующих веществ из сбора нейропротективного, разработать рациональную технологию получения экстракта сухого («Брэйн-профит») и изучить его химический состав;

– разработать показатели стандартизации для корней астрагала перепончатого, сбора нейропротективного и «Брэйн-профит» экстракта сухого;

– разработать проекты нормативной документации: ФС на корни астрагала перепончатого, ФСП на сбор нейропротективный, Лабораторный регламент на производство сбора нейропротективного, ФСП на «Брэйн-профит»

экстракт сухой, Лабораторный регламент на производство «Брэйн-профит»

экстракта сухого.

Научная новизна Впервые проведено фармакогностическое изучение корней астрагала перепончатого, произрастающего в Восточной Сибири. Установлены макро-и микроскопические признаки, позволяющие установить подлинность растительного сырья. С использованием современных методов анализа установлено наличие флавоноидов, фенолкарбоновых, оксикоричных, коричной и аскорбиновой кислот, дубильных веществ, кумаринов, тритерпеновых сапонинов, углеводов, белковых веществ и алкалоидов. Изучен состав жирных кислот, из них ненасыщенные – линолевая, -линоленовая, олеиновая кислоты. Определен аминокислотный и минеральный состав. Установлено количественное содержание основных действующих веществ: свободных аминокислот (10,28±0,30%), тритерпеновых сапонинов (1,51±0,04%), углеводов (СУ – 9,23%, ВРПС – 8,32%, ПВ – 7,02%, Гц А – 13,17%, Гц А – 2,12%), флавоноидов в корнях астрагала перепончатого, а также изучена зависимость накопления свободных аминокислот от фазы вегетации, наибольшее их содержание отмечено в фазу плодоношения.

Обоснован и разработан оптимальный вариант сбора нейропротективного, включающий три вида растительного сырья. Определено количественное содержание БАВ в сборе: флавоноидов 9,67±0,32%, свободных аминокислот 3,66±0,18%, кумаринов 0,80±0,03%, тритерпеновых сапонинов 0,06±0,01%, полисахаридов 4,59±0,20; органических кислот 1,22±0,05%, дубильных веществ 1,38±0,02%, аскорбиновой кислоты 1,55±0,06%, эфирных масел, жирных кислот, свободных углеводов, макро- и микроэлементов.

Установлена зависимость выхода свободных аминокислот и флавоноидов от режимов экстрагирования и разработана технология получения «Брэйн-профит»

экстракта сухого; изучен химический состав и предложены критерии для оценки его качества.

Для стандартизации исследуемых средств разработаны методики количественной оценки суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин для корней астрагала перепончатого, суммы флавоноидов в пересчете на байкалин и суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин для сбора нейропротективного, «Брэйн-профит» экстракта сухого; а также установлены нормы содержания свободных аминокислот для корней астрагала перепончатого – не менее 10,0%, нормы содержания флавоноидов и свободных аминокислот для сбора – не менее 6,0% и 3,0% и для экстракта сухого – не менее 24,0% и 7,5%.

Предложенные методики валидированы.

Для сбора нейропротективного, «Брэйн-профит» экстракта сухого установлена нейропротективная активность, подтвержденная фармакологическими исследованиями (Приложение 2).

Практическая значимость работы По результатам исследований разработаны проект Фармакопейной статьи (ФС) на корни астрагала перепончатого, проекты Фармакопейных статей предприятий (ФСП) на сбор нейропротективный и «Брэйн-профит» экстракт сухой, лабораторные регламенты на производство сбора нейропротективного и «Брэйн-профит» экстракта сухого (Утв. на засед. Уч. Сов. ИОЭБ СО РАН, протокол №10 от 18.12.2014). Методика количественного определения свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого апробирована на ООО «Малое инновационное предприятие «Арура» (Акт о внедрении от 23.10.2014) (Приложение 1). Методики количественного определения БАВ в сборе нейропротективном внедрены в учебный процесс кафедры фармации Бурятского Государственного Университета (Акт о внедрении от 23.10.2014) (Приложение 1).

Работа выполнена в соответствии с программой и планом научноисследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по проекту № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденному президиумом СО РАН, а также при поддержке Фонда Михаила Прохорова, проект «Академическая мобильность» (Решение Экспертного Совета Фонда Михаила Прохорова, выписка №5 из Протокола №4 от 21.03.2014.).

Личный вклад автора Автор принимал участие в выборе направления исследования, постановке целей и задач, выборе объекта исследования, проведении экспериментальных работ, обобщении полученных данных и их статистической обработки.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертационной работы соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют пунктам 2, 3, 6.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии.

Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград, 2012); XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013); VI International scientific conference «Traditional medicine: ways of integration with modern health care» (Ulan-Ude, 2013).

Публикации. Основное содержание работы

отражено в 7 научных работах, из них 3 статьи - в изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

На защиту выносятся:

– результаты морфолого-анатомического и фитохимического изучения корней астрагала перепончатого;

– данные по разработке рационального состава и соотношения компонентов сбора нейропротективного;

– результаты исследований по разработке способа получения сбора нейропротективного и «Брэйн-профит» экстракта сухого;

– результаты фармакогностического изучения сбора и фитохимического изучения экстракта сухого;

– результаты исследований по стандартизации корней астрагала перепончатого, сбора нейропротективного и «Брэйн-профит» экстракта сухого.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 286 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, трех глав, посвященных экспериментальным исследованиям, общих выводов, списка используемой литературы и 5 приложений. В тексте работы приведены 65 таблиц и 51 рисунок.

Библиографический указатель содержит 262 источника, из которых 121 - на иностранных языках.

ГЛАВА ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. РАСТИТЕЛЬНЫЕ

I.

НЕЙРОПРОТЕКТОРЫ – ПЕРСПЕКТИВНЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ

ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ.

1. 1. Этиология и патогенез цереброваскулярных заболеваний В настоящее время около одного миллиарда человек во всем мире страдают неврологическими нарушениями [18], среди которых обширную группу составляют цереброваскулярные заболевания [42, 49, 96, 110]. Показатели смертности от инсульта в России одни из самых высоких по сравнению с Европой и в 6 раз превышают аналогичные показатели в США [45, 105]. В структуре цереброваскулярных заболеваний различают острые и хронические нарушения мозгового кровообращения [70].

Острые нарушения мозгового кровообращения определяют как быстро возникающие очаговые и общемозговые (диффузные) нарушения функции головного мозга сосудистого генеза. Они представляют собой наиболее распространенные заболевания головного мозга в зрелом и пожилом возрасте. К острым нарушениям мозгового кровообращения относятся ишемические инсульты, геморрагические инсульты, транзиторная ишемическая атака (являющаяся преходящим нарушением мозгового кровообращения), острая гипертоническая энцефалопатия (гипертензивная энцефалопатия).

Хронические формы цереброваскулярных заболеваний, согласно принятой в России классификации сосудистых заболеваний головного и спинного мозга, выделены в разделе «прогрессирующие нарушения мозгового кровообращения».

К группе хронических нарушений мозгового кровообращения относятся начальные проявления недостаточности кровоснабжения мозга и дисциркуляторная энцефалопатия.

К числу основных факторов риска ишемических нарушений мозгового кровообращения относятся пожилой и старческий возраст, артериальная гипертония, гиперхолестеринемия, атеросклероз церебральных и прецеребральных (сонных и позвоночных) артерий, курение, заболевания сердца (мерцательная аритмия, инфаркт миокарда и другие), сахарный диабет.

Ишемические нарушения мозгового кровообращения примерно в 90-95 % случаев вызваны атеросклерозом церебральных и прецеребральных артерий, поражением мелких церебральных артерий вследствие артериальной гипертонии, сахарного диабета или кардиогенной эмболией. В более редких случаях (5-10%) они обусловлены васкулитом, гематологическими заболеваниями, иммунологическими нарушениями, венозным тромбозом, расслоением прецеребральных или церебральных артерий, мигренью, у женщин – приемом оральных контрацептивов [64, 70, 85, 140].

В основе ишемических поражений головного мозга лежат реакции глутамат-кальциевого каскада, развивающиеся в первые минуты и часы после сосудистого инцидента [93]. В развитии глутамат-кальциевого каскада выделяют три основных этапа: индукция (запуск), ампфликация (усиление повреждающего потенциала) и экспрессия (конечные реакции каскада, непосредственно приводящие к гибели клетки).

Первый этап — индукция характеризуется нарушением энергетического метаболизма (активацией гликолиза, дискоординацией в цикле Кребса, торможением дыхания в митохондриальной цепи, дефицитом АТФ), усилением выброса возбуждающих аминоацидергических нейротрансмиттеров, развитием глутаматной эксайтотоксичности и «шоковым» притоком Ca2+ в нейроны.

Второй этап — амплификация характеризуется внутриклеточным накоплением ионов распространяющейся глутаматной Ca2+, эксайтотоксичностью.

Третий этап — экспрессия. На этом этапе происходит развитие оксидативного стресса и накопление низкомолекулярных цитотоксических продуктов – активных форм кислорода (АФК). Необходимо отметить, что свободное железо (II) участвует в образовании АФК в основном на инициальных этапах развития глутамат - кальциевого каскада и высокий уровень железа в нервной ткани зависит от повышения концентрации Ca2+ в этих же системах.

При ишемии резко возрастает образование АФК в митохондриях при разобщении дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования. Причем скорость образования АФК находится в прямой зависимости от степени блокирования дыхательной цепи.

Усиление образования АФК в ишемизированном мозге происходит при снижении функциональной активности антиоксидантной системы нейрона. В настоящее время выделяют четыре группы антиоксидантной системы нейрона [100].

К первой группе антиоксидантной системы относят жирорастворимые эндогенные антиоксиданты: токоферолы, убихиноны, ретинолы и мелатонин.

Наибольшее значение в защите нейрона в условиях ишемии имеет вторая группа, к которой относят антиоксидантные ферменты — СОД, каталазу, глутатионредуктазу, соединения, которые содержат тиоловые и селеногруппы (цистеин, метионин и цистин), а также гистидинсодержащие дипептиды (карнозин, анзерин, гомокарнозин).

Третью защитную систему нейрона составляют два фермента — глутатионпероксидаза и глутатионтрансфераза. Основной функцией данных ферментов является восстановление гидроперекисей до спиртов.

Четвертая защитная система существует для детоксикации Fe2+ и представлена церулоплазмином, трансферрином, ферритином и лактоферрином. Система регулирует металлкатализируемые реакции образования гидроксил-радикала (реакции Фентона и Габера — Вейсса). В условиях ишемии мозга недостаток данных белков приводит к усилению свободно радикального окисления и более выраженному неврологическому дефициту.

Резкое усиление продукции АФК в условиях антиоксидантной недостаточности приводит к развитию оксидативного стресса, являющегося основным универсальным механизмом повреждения головного мозга.

В свете современных представлений о патогенезе мозгового инсульта формирование ишемического каскада повреждения мозга можно представить схемой последовательных этапов: 1) снижение мозгового кровотока; 2) глутаматная эксайтотоксичность; 3) внутриклеточное повышение кальция; 4) активация Са-зависимых ферментов; 5) повышение синтеза АФК и развитие оксидативного стресса; 6) митохондриальная дисфункция.

Лекарственные средства, обладающие нейропротективным 1.2.

действием Нейропротекторы относятся к ноотропным препаратам смешанного типа с широким спектром эффектов. Терапевтическое действие ноотропных препаратов осуществляется за счет улучшения энергетического состояния нейронов (усиление синтеза АТФ, антигипоксический и антиоксидантный эффекты);

активации пластических процессов в центральной нервной системе (ЦНС) путем усиления синтеза РНК; усиления процессов синаптической передачи в ЦНС;

улучшения утилизации глюкозы; мембраностабилизирующего эффекта.

Нейропротективная терапия предполагает антиоксидантное, антиэксайтотоксическое (предупреждающее гибель клеток), блокирующее ионы кальция и нейротрофическое действие.

К веществам, обладающим нейропротективным действием относят [51]:

• антиоксиданты (ферментные и неферментные системы инактивации АФК);

• блокаторы кальциевых каналов (антагонисты Ca2+);

• вещества, влияющие на систему ГАМК (модуляторы рецепторов ГАМК);

• активаторы метаболизма мозга;

• церебральные вазодилятаторы;

• вещества различных групп.

Интегративная деятельность мозга, фиксация, консолидация, хранение и воспроизведение информации являются высшими, сложнейшими процессами ЦНС, в основе которых лежит изменение синаптической передачи и нейрональной пластичности. В поликомпонентный механизм реализации указанных процессов вовлекаются изменения на разных уровнях нервной системы: от клеточного до органного. Поэтому многообразны мишени для воздействия веществ на эти процессы. Приведенная ниже классификация основана на представлениях о механизмах действия веществ, а также учитывает и их химическое строение [17].

Классификация веществ с ноотропным и нейропротекторным действием:

1. Активаторы метаболизма мозга и белково-нуклеинового синтеза

1.1. Пирролидоновые ноотропные препараты: пирацетам, фенотропил, оксирацетам, анирацетам, прамирацетам, этирацетам, дипрацетам, ролзирацетам, небрацетам, изацетам, нефирацетам, детирацетам, алорацетам, тенилсетам, фасорацетам, леветирацетам, унифирам, сунифирам.

1.2. Вещества природного происхождения и близкие к ним: церебролизин, аналоги церебролизина N-PEP-12 и Е021, актовегин, церебрал, липоцеребрин, цереброкурин, кортексин, пиритинол, пиявит, пантогематоген, полидан.

2. Ноотропные препараты, реализующие действие через нейромедиаторные системы

2.1. Холинергические вещества 2.1.1. Вещества, вызывающие усиление синтеза ацетилхолина и его выброса:

холин фторид, фосфотидилсерин, лецитин, ацетил-L-карнитин.

2.1.2. Ингибиторы ацетилхолинэстеразы: донепезил, ривастигмин, галантамин, физостигмин, такрин, амиридин, нейромедин, метрифонат, велнакрин малеат, эртастигмин, зифросинол, минаприн, капроктамин, гаперзин А, фенсерин.

2.1.3. Агонисты М-холинорецепторов: ксаномелин, миламелин, сабкомелин, цевимелин, оксотреморин.

2.1.4. Агонисты Н-холинорецепторов: АВТ098, АВТ089, АВТ418, эпибатид, анабазин.

2.2. Вещества, влияющие на систему возбуждающих аминокислот: глутаминовая кислота, мемантин, милацемид, глицин, Д-циклосерин, нооглютил, ампалекс, анирацетам, унифирам, сунифирам, 4-аминопиперидины, димебон, СРАLС36.

2.3. Вещества, влияющие на систему ГАМК: гаммалон, натрия, лития и кальция оксибутират, пикамилон, фенибут, пантогам, никотинамид, габапентин.

2.4. Вещества, влияющие на серотонинергическую систему: халипроден, ондансетрон, мирисетрон.

2.5. Вещества, влияющие на дофаминергическую систему и ингибиторы МАО:

пирибедил, сумаринол, лазабемид, селегилин, расагилин.

2.6. Вещества, влияющие на аденозиновую систему, фосфодиэстеразу: кофеин, пропентофиллин, ролипрам.

2.7. Вещества, влияющие на гистаминовую систему: А349821.

2.8. Вещества, влияющие на каннабиноидную систему.

3. Нейропептиды и их аналоги: АКТГ 1-10 и его фрагменты, эбиратид, семакс, ноопепт, соматостатин, вазопрессин, тиролиберин, нейропептид Y, субстанция Р, ангиотензин-II, беклимин.

4. Нейростероиды и мелатонин: 7--эстрадиол, эстадерм, карбеноксолон, мелатонин.

5. Антиоксиданты: мексидол, дибунол, фосфотидилсерин, пиритинол, эксифон, тирилазад месилат, атеровит, гингко билоба.

6. Антагонисты кальция: нимодипин, нивалдипин, циннаризин, флунаризин.

7. Церебральные вазодилататоры: винкамин, винпоцетин, ницерголин, гидергин, винконат, виндебумол, нафтидрофурил.

8. Вещества, влияющие на протеинкиназы: этимизол.

9. Витамины и их аналоги, пищевые добавки, вещества растительного происхождения: витаимны Е, В1, В6, В12, В15, Вс, лецитин, L-карнитин, ацетил-Lкарнитин, гингко билоба, женьшень, лимонник.

10. Вещества, влияющие на нейротрофиновую систему: прямые и непрямые активаторы Trk-рецепторов; вещества, влияющие на экспрессию и секрецию нейтрофинов, церебролизин.

11. Вещества, влияющие на процесс нейродегенерации при болезни Альцгеймера:

вещества, уменьшающие синтез и влияющие на агрегацию, деагрегацию и депонирование -амилоида и производящие «очистку» амилоидных бляшек, хелатирующие металлы, статины, противовоспалительные средства.

12. Средства для лечения синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ) у детей и взрослых: метилфенидат, амфетамины, атомоксетин, модафинил, фенибут, фенотропил.

13. Комбинированные препараты: фезам, винпотропил, ороцетам, диапирам, нейронал, инстенон, цитофлавин.

14. Вещества из разных групп: оротовая кислота, метилглюкооротат, фолиевая кислота, ганглиозиды, глюкокортикоиды, геровитал Н3, диметиламиноэтанол, СДР-холин.

Нейропротекторы растительного происхождения относятся к различным группам химических соединений: алкалоиды, флавоноиды (катехины, проантоцианидины, флавоны, флавонолы, бифлавоноиды), таннины, фенольные кислоты и их производные, терпеноиды (монотерпеноиды алифатические, моноциклические, бициклические, хиноны), дитерпеноиды (хиноны, лактоны, кислоты, спирты), тритерпеноиды, полиацетиленовые спирты, нейротрансмиттерные аминокислоты, L-теанин, производные ксантина, витамины (токоферолы, аскорбиновая кислота).

Большое разнообразие биологически активных соединений, способных оказывать нейропротективный эффект, в составе растений обусловлено различными механизмами реализации данного эффекта [51].

1.3. Растительные нейропротекторы В настоящее время изучено более 100 лекарственных растений, оказывающих антиоксидантные, анксиолитические, антидепрессивные, нейролептические и ноотропные эффекты [17, 51, 222, 262]. В ряду данных растений наиболее выраженными нейропротективными свойствами обладают корни астрагала перепончатого и корни астрагала монгольского, корни шлемника байкальского, корневища и корни вздутоплодника сибирского, корни родиолы розовой, трава готу кола, плоды лимонника китайского, корневища и корни валерианы лекарственной, листья гинкго билоба, корни и корневища элеутерококка, корни и корневища аралии маньчжурской.

Родиола розовая общеизвестна своими выраженными адаптогенными свойствами, и сходна с препаратами женьшеня и элеутерококка. Препараты, полученные из корней и корневищ родиолы розовой, оказывают стимулирующее влияние на ЦНС, улучшают энергетическое обеспечение мозга, способствуют нормализации обменных процессов, улучшают умственную и физическую работоспособность, что обусловлено наличием в ее химическом составе бензеноидов: родиолозидом и розавином [90, 111, 119, 140, 245].

Гинкго билоба обладает выраженными ноотропными, нейропротективными и адаптогенными свойствами [5, 157, 170, 180, 181, 187, 188, 228, 243, 255].

Комплексный эффект обусловлен его, во многом уникальными, действующими компонентами: флавоноидные гликозиды и терпеновые лактоны [121]. Широко известны препараты: «Билобил», «Танакан», «Мемоплант» [43, 197]. Препараты на основе гинкго билоба улучшают мозговое кровообращение, снабжение мозга кислородом и глюкозой, обладают сосудорасширяющим действием, препятствуют агрегации тромбоцитов, нормализуют метаболические процессы, оказывают антигипоксическое действие на ткани, препятствуют перекисному окислению липидов и образованию свободных радикалов клеточных мембран, а также оказывают выраженное противоотечное действие в тканях головного мозга [5, 76, 172, 229].

В традиционной китайской медицине издавна использовали плоды лимонника китайского для снятия усталости и укрепления сил [261]. Плоды и семена используют в качестве лекарственного средства, оказывающее адаптогенное, общетонизирующее и психостимулирующее действие.

Тонизирующее действие плодов определяется схизандрином, который повышает возбудимость ЦНС и стимулирует работу сердца и дыхательного аппарата, повышает артериальное давление, усиливает процессы возбуждения в структурах головного мозга и рефлекторную деятельность, повышает работоспособность и уменьшает утомление при физических и умственных нагрузках [219, 233].

В экспериментах на животных установлено, что экстракт и отвар из корней астрагала монгольского обладают выраженной анксиолитической активностью, которая сочетается с антиамнестическими и антидепрессивными свойствами.

Анксиолитический эффект астрагала монгольского сравним с антиконфликтным действием феназепама [69, 71, 133, 134, 196, 249].

Валериану лекарственную широко применяют в качестве седативного лекарственного средства при повышенной нервной возбудимости, бессоннице, сердечных неврозах, спазмах кровеносных сосудов, гипертонии, мигрени, истерии, спазмах органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), почечной и печёночной коликах, приливах крови к голове, особенно у женщин в климактерическом периоде, заболеваниях щитовидной железы, гипертиреозе, для лечения нейродермитов. Корневища с корнями входят в состав седативных и желудочных сборов [171, 231, 252].

Трава пустырника, соплодия хмеля, цветки липы, трава мелиссы, мяты перечной, корни и трава пиона, цветки лабазника, трава чабреца, цветки ромашки, трава зверобоя оказывают седативный и противотревожный эффекты и применяются для снятия психо - эмоционального напряжения, усталости [27, 50, 134, 162, 222, 262]. Корни женьшеня, корни аралии, корневища и корни элеутерококка обладают выраженным тонизирующим действием [43,76,145].

Антигипоксическим действием обладают листья березы, трава мелиссы, сушеницы, листья крапивы двудомной, корневища и корни девясила, трава живокости [51, 100, 119]. Антигипертензивными свойствами обладают корневища аира, плоды рябины черноплодной, плоды боярышника, плоды шиповника, плоды черники [88].

Эпидемиологические исследования доказали выраженное благотворное влияние индивидуальных веществ группы флавоноидов на заболевания, связанные с атеросклерозом и нейродегенеративными процессами.

Церебропротекторное действие флавоноидов реализуется за счет их способности моделировать внутриклеточные механизмы восстановления и выживания. Также флавоноиды проявляют антиоксидантный, противовоспалительный, противоаллергический, кардиопротекторный, антигипертензивный, гепатопротекторный, антибактериальный, противоопухолевый и эстрогенный эффекты.

Наиболее изученными представителями данного класса соединений, обладающими выраженной нейропротективной активностью, являются:

кверцетин, рутин, лютеолин, дигидрокверцетин, гесперидин [17, 51, 95, 100, 214, 222, 232, 262].

–  –  –

и кровотечениях.

В настоящее время многочисленными экспериментальными работами доказаны разнообразные фармакологические свойства отдельных соединений и суммарных фракций, полученных из корней астрагала перепончатого:

1. Кардиопротективный. Исследования показали, что астрагалозиды проявляют защитное действие на поврежденный миокард [189]. Они снижают внутриклеточную концентрацию ионов Ca2+, ускоряют удаление свободных радикалов, уменьшают перекисное окисление липидов кардиомиоцитов, тем самым восстанавливают поврежденные клетки миокарда [175]. Экстракт корней проявляет антиангинальную активность при ишемической болезни сердца (ИБС), при инсультах, способствует неоваскуляризации в ишемизированных зонах, оказывает вазорелаксирующее, антикоагулянтное, гемопоэтическое действие.

Астрагал перепончатый ингибирует агрегацию тромбоцитов, снижает агрегацию плазминогена [150, 159, 174, 194].

2. Иммуномодулирующий. Экстракт корней астрагала перепончатого обладает иммуностимулирующей и противоопухолевой активностью. Он способствует распространению человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (МНК ПК), повышает активность Т-лимфоцитов против опухолевых клеток, усиливает фагоцитоз опухолевых клеток и продукцию цитокинов (ФНО- и ИЛ-8) моноцитами, увеличивает продукцию IgG Bлимфоцитами в периферической крови [254].

3. Антиоксидантный. В результате проведенных исследований экстракт корней астрагала перепончатого доказал выраженную антиоксидантную активность. Флавоноиды и сапонины, содержащиеся в экстракте, существенно подавляют перекисное окисление липидов (ПОЛ) мембран клеток, вызванное АФК (О2-, Н2О2) и УФ-лучами [203]. Корни астрагала перепончатого ингибируют развитие окислительного стресса, возникающего в результате ПОЛ и окислительной модификации белков под воздействием ионов меди [249]

4. Омолаживающий. Полисахариды и сапонины растения предупреждают старение животных [247].

5. Противоопухолевый. Установлено, что экстракт корней астрагала перепончатого обладает антиканцерогенным действием за счет увеличения продукции и активности цитокинов [239]. Получены данные о подавлении роста гепатоцеллюлярной карциномы астрагалозидом в исследованиях на IV человеческих клетках [224].

6. Противовирусный. В опытах in vivo и in vitro экстракт корней астрагала перепончатого при лечении вирусного миокардита, вызванного вирусом Коксаки, проявлял антивирусную активность в отношении вируса герпеса типа 1, вируса гриппа [193, 208, 238].

7. Противовоспалительный. Исследования показали, что экстракт корней астрагала ингибирует синтез простагландинов (ЦОГ-2), интерлейкинов (ИЛ-6, ИЛ-1), лейкотриенов, а также ФНО- [144, 258].

8. Противодиабетический. Экстракт корней астрагала перепончатого используется для лечения сахарного диабета и его осложнений, при диабетической нефропатии [204]. Выраженный лечебный эффект при сахарном диабете I и II типа обусловлен наличием в корнях растения суммы полисахаридов, сапонинов астрагалозида II и изоастрагалозида I [207].

9. Нейропротективный. Экстракты, полученные из корней и надземной части астрагала перепончатого, оказывают защитное действие при глутаматной интоксикации нейронов мозжечка крыс путем стимуляции внутриклеточных энергетических ресурсов [71, 108]. Получены данные о нейропротективном эффекте астрагалозида IV при болезни Паркинсона [216] и при ишемических состояниях на моделях с животными за счет увеличения проницаемости гематоэнцефалического барьера Доказано противоишемическое действие [149].

каликозина (изофлаваноида, получаемого из корней астрагала) при гипоксическом поражении эндотелиальных клеток кровеносных сосудов [178, 195].

10. Гепатопротекторный. Сумма флавоноидов экстракта корней астрагала обладает выраженным защитным действием при поражении печени у крыс парацетамолом [236]. Фракция сапонинов из корней астрагала значительно снижает развитие фиброза печени, вызванного CCl4 [207].

Корни астрагала перепончатого активно используются в клинической практике многих стран Востока для лечения таких заболеваний, как инфекции дыхательных путей [217], легочно-сердечная недостаточность [210], астма [261], хронический бронхит [198], хроническая застойная сердечная недостаточность [165], ИБС [142], вирусный миокардит [176], диабетическая нефропатия, хронический гломерулонефрит [248], вирусный энтерит [218], язвенная болезнь желудка (ЯБЖ) [237], вирусный гепатит [164].

Химический состав корней астрагала перепончатого.

Основными действующими веществами корней астрагала перепончатого являются сапонины (астрагалозиды, агроастрагалозиды, астрамембранозиды и др.), флавоноиды (флавоны, изофлавоны, изофлавононы, птерокарпаны), аминокислоты и полисахариды (астрагаланы и др.) [151, 102, 161, 202, 225, 226, 227, 251, 257, 259].

В настоящее время, выделено и идентифицировано около 40 сапонинов, большинство которых принадлежат к группе тетрациклических тритерпеноидов.

Агроастрагалозид I (1), агроастрагалозид II (2), хуанцигенин II (3), хуанцигенин В (4), монголикозид I (5), монголикозид II (6), циклоастрагенол (10), хуанцигенин А (24) и хуанцигенин I (26), астрагалозид III (13), астрагалозид V (14) и астрагалозид VI (15), выделены и идентифицированы Kitagawa и др. в 1983 г.

Также, в 1983 г. учеными Kitagawa, Wang и Yoshikawa выделены и идентифицированы: астрагалозид I (11), астрагалозид II (12), изоастрагалозид II (18), ацетиластрагалозид I (22) и астрагалозид IV (27), астрагалозид VII, астрагалозид VIII (31) и соясапонин I (32). Позже, в 1987 г. были выделены изоастрагалозид IV (19), агроастрагалозид III (20), агроастрагалозид IV (21), хуангциенин D (23) и астрамембранин II (26), немного позже сапонины – астрамембранозид А (29), астрамембранозид В (9) и малониластрагалозид (30), структуры которых представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 - Химические структуры сапонинов корней астрагала перепончатого

Флавоноиды корней астрагала перепончатого представлены флавонолами:

кемпферол (1), кверцетин (2), изорамнетин (3), рамноцитрин (4) и куматекин (5);

изофлавонами: формононетин (8), каликозин (9), 3'-метокси-5'-гидроксиизофлавон-7-О--D-глюкозид (15), (3R)-2',3'-дигидрокси-4',7-диметоксиизофлавон (16), ононин (17), 3',8-дигидрокси-4',7-диметоксиизофлавон (10), одоратин-7-О-D-гдюкопиранозид 3',7-дигидрокси-4',8-диметоксиизофлавон каликозин-7-О--D-глюкопиранозид (13), каликозин-7-О--D-глюкозид-6''-Омалонат (14); изофлаванонами: 2'-гидрокси-3',4'-диметоксиизофлаванон-7-О--Dглюкопиранозид (18), 2'-гидрокси-3',4',7-триметоксиизофлаванон (19), 2',7дигидрокси-3',4'-диметоксиизофлаванон-7-О--D-глюкозид (22), 8,2'-дигидроксидиметоксиизофлаванон (20), 2',3',7-тригидрокси-4'-метоксиизофлаванон (21);

птерокарпанами: 3,9,10-триметоксиптерокарпан (23), (6а R,11 а R) – 10 гидрокси-3,9-диметоксиптерокарпан (24), 9,10-диметоксиптерокарпан-7-О--Dглюкопиранозид (25). Структуры выделенных флавоноидных соединений приведены на рисунке 2.

Рисунок 2 - Химические структуры флавоноидов корней астрагала перепончатого Химическое исследование корней астрагала перепончатого, произрастающего в Китае, показало, что общее содержание изофлавоноидов составляет 0,75%, астрагалозидов – 1,96%, водорастворимых полисахаридов – 6,83%, аминокислот – 0,44% [161]. Кроме того, определены связанные аминокислоты: – аминомаслянная кислота, аргинин, пролин, лизин, гистидин, аспарагиновая кислота, треонин, серин, глутаминовая кислота, тирозин, фенилаланин, изолейцин, лейцин, глицин, аланин, валин, метионин.

В настоящее время уделяется большое внимание установлению внутривидовых различий A. membranaceus (Fisch.) Bunge, A. propinquus Различия между указанными видами Schischkin, A. mongolicus Bunge.

устанавливают с помощью физико-химических методов (гликозидные «флавоноидные профили») и молекулярно-генетического подхода [55, 101, 234, 260].

1.4.2. Корни шлемника байкальского Шлемник байкальский – Scutellaria baicalensis Georgi семейства яснотковые

– многолетнее травянистое поликарпическое растение, (Lamiaceae) произрастающее на юге Забайкальского края и Амурской области, в Республике Бурятия, Приморском крае и на юго-западе Хабаровского края, очень редко – на юго-востоке Иркутской области. За пределами нашей страны встречается в Монголии, Японии, многих провинциях Китая [137].

Шлемник байкальский является ценным лекарственным растением. Он издавна применяется в китайской, тибетской, монгольской и бурятской медицине.

Работами Гриневич М. А. и Брехмана И. И. установлено, что корни шлемника байкальского входят в десятку наиболее часто употребляемых «элитных»

растений с адаптогенным действием в странах Востока [135]. Он назначался как жаропонижающее, укрепляющее, седативное, противосудорожное средство, при функциональных расстройствах центральной нервной системы [11]. В тибетских трактатах («Вайдурья-онбо», Шэлпхрэнг», «Джуд-ши») и в практике лам-лекарей Бурятии шлемник байкальский известен под названием хонг лэн [128], применялся как средство для лечения жара, возникающего от борьбы «рлунг», «мкхрис» и «бадкан», при жаре полых и плотных органов. [128]. В китайской медицине растение известно под названием хуан-цзинь [11, 137]. В монгольской народной медицине его использовали для укрепления и омоложения организма [128].

Широкое использование шлемника байкальского в народной и традиционной медицине обусловлено уникальным химическим составом и разнообразными фармакологическими свойствами растения. Основным фармакологическим свойством шлемника байкальского является его влияние на центральную и периферическую нервную систему. Установлено седативное и гипотензивное действие отваров, настоев и суммарных экстракционных препаратов из корней данного растния [135].

–  –  –

антагонизма к ГАМКА-рецепторам [167].

Данные исследования подтверждают возможность использования отдельных флавоноидов шлемника байкальского в качестве противоэпилептических средств.

В экспериментах на животных, ороксилин А и байкалеин устраняет амнезию, вызванную введением 25-35 фрагмента - амилоидного белка A25–35, играющего важную роль в патогенезе болезни Альцгеймера [177, 242].

Ороксилин А, вводимый внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг предотвращает амнезию, индуцированную введением скополамина [240].

При изучения влияния байкалеина на когнитивные функции при оксидативном стрессе обнаружено, что он увеличивает экспрессию фосфорилированной ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase), фосфорилированного фактора транскрипции СREB (cyclic-AMP Response Element Binding Protein) и уровень нейротрофического фактора мозга BDNF (brain-derived neurotrophic factor), но не увеличивает экспрессию фосфорилированной Akt (протеинкиназы В) в гиппокампе [211].

Важной составляющей нейропротективного эффекта флавоноидов шлемника байкальского является подавление воспалительных реакций, возникающих в ишемизированных тканях мозга, за счет ингибирования образования NO, интерлейкина 1 (ИЛ - 1) и фактора некроза опухоли – (НФО-) [154, 244].

Отвары шлемника байкальского, а также отдельные флавоноидные соединения обладают выраженной противоопухолевой и антиметастазирующей активностью, служат гемостимуляторами в условиях противоопухолевой химиотерапии, что доказано отечественными и зарубежными учеными [66, 106, 135, 139, 185, 230]. В экспериментах выявлено антибактериальное [246], противовирусное [213], противогрибковое [256], противовоспалительное [200, 250], жаропонижающее [241] и противоаллергическое [206] действие растения.

Шлемник байкальский регулирует обмен веществ, улучшает пищеварение, повышает аппетит, оказывает желчегонное и гепатопротекторное действие [223].

В РФ в качестве ЛС зарегистрированы корни шлемника байкальского.

Также корни шлемника байкальского служат сырьем для получения жидкого экстракта и скутэкса, разрешенных к медицинскому применению на Украине [115, 135]. «Экстракт шлемника байкальского жидкий» является гипотензивным и седативным средством, применяемым для лечения гипертонической болезни I и II стадии у взрослых и детей старше 12 лет, которая протекает с явлениями повышенной возбудимости. При дополнительных исследованиях установлено, что экстракт шлемника байкальского жидкий может быть использован как противоопухолевое, радиозащитное и гемостимулирующее средство при химиотерапии и лучевой терапии опухолей [135]. «Скутэкс» — экстракт сухой в виде таблеток, покрытых оболочкой. Препарат проявляет ноотропные свойства, улучшает процессы обучения и памяти, уменьшает последствия гипоксической травмы при профилактическом применении и лечении развитой энцефалопатии в отдаленные периоды после полученной травмы [115].

В последние годы ведутся работы по созданию новых ЛС, на основе травы и корней шлемника байкальского, к ним относятся: «Зилинат» — байкалинат лизина, полученный путем полусинтеза из флавоноидного глюкуронида байкалина и аминокислоты лизина. Предназначен для лечения аутоиммунных анемий, костно - мозговых гипоплазий, а также в качестве гемостимулирующего средства у онкологических больных при проведении цитостатической химио- и лучевой терапии, находится на второй фазе клинических испытаний; «Гистинат»

— байкалинат гистидина, полученный путем полусинтеза из флавоноидного глюкуронида байкалина и аминокислоты гистидина. Он обладает противовоспалительным, спазмолитическим действием, ингибирует биосинтез лейкотриенов, проявляет выраженное лечебно-профилактическое действие на моделях патологических процессов легких и бронхов, уменьшает реактивность и воспалительные процессы респираторного отдела легких, препятствует развитию дыхательного ацидоза при альвеобронхите. Гистинат используется для лечения бронхиальной астмы, хронических бронхитов и пневмокониозов, и успешно прошел первую фазу клинических испытаний, назначена вторая фаза изучения, предлагается в виде таблеток; «Аспалин» — смесь байкалината лизина с калиймагниевой солью аспарагиновой кислоты (аспаркам), прошел 2 фазы клинических испытаний; «Байкафед» — байкалинат эфедрина, получен путем полусинтеза из флавоноидного глюкуронида байкалина и алкалоида эфедрина.

Он проявляет антиастматические свойства и находится на первой фазе клинических испытаний, предлагается в виде таблеток [115].

Растение пользуется большой популярностью в Китае, Японии и Корее и входит в состав многих комплексных фитопрепаратов: Sihoga-Yonggol-MoryoTang (лечение нервно-психических, сосудистых и онкологических заболеваний), Huanglian-Jie-Du-Tang (лечение гепатита, ЯБЖ, деменции, цереброваскулярных заболеваний), (лечение заболеваний печени и Dahuang Zhechoung гинекологических заболеваний), San-Huang-Xie-Xin-Tang (лечение артериальной гипертензии, ЯБЖ и гастрита), Huang-Lian-Jie-Du-Decoction (лечение сахарного диабета), Saiboku-To (лечение бронхиальной астмы и бронхита), GamiChunghyuldan (противоишемическое и противовоспалительное средство), Qiankun-Nin (лечение сердечно-сосудистых заболеваний), PS-SPES (лечение рака простаты), (нейропротективное средство), HT008-1 Huang-Lin-Jie-Du-Tang (лечение воспалительных заболеваний), Xiao-Chai-Hu-Tang (лечение вирусных и бактериальных инфекций) [192].

Химический состав корней шлемника байкальского.

Фармакологическое действие полученных средств из корней шлемника байкальского обусловлено содержанием фенольных соединений. Изучение флавоноидов растения начато с конца прошлого века японским ученым Takahashi, выделившим скутелляреин. Позднее ученым Shibata были выделены новые вещества - вогонин и байкалин, а из надземной части - скутелляреин. Эти данные в дальнейшем подтвердили Дьяконова Л. Н., Минаева В.Г., Хныкина Л. А. [135].

Начиная с 60-х годов химическим изучением интенсивно занимались ученые Украины и Японии, в результате им удалось разделить сложные смеси природных флавоноидов шлемника байкальского. Ими выделено и идентифицировано более 50 соединений флавоноидного характера.

В настоящее время, из литературных источников известно о расшифровке более 125 соединений фенольной природы, из них 81 производное флавона: 55 агликонов и 26 гликозидов [81], преобладают такие соединения как: байкалин, вогонин, вогонизид, байкалеин, ороксилин А и ороксилин А-7-глюкуронид [192], структурные формулы представлены на с. 27 (рисунок 3).

По характеру замещения основного скелета флавона все соединения можно разбить на 5 групп: ди-, три-, тетра-, пента- и гексазамещенные. Дизамещенные флавоны представлены 5,7-замещенным хризином и его двумя гликозидами.

Тризамещенные флавоны – вторая по объему группа, делится на четыре типа:

байкалеина (5,6,7), норвогонина (5,7,8), 2-оксихризина (5,7,2) и апигенина (5,7,4). Группа тетразамещенных флавонов самая объемная (30 соединений).

Флавоны S. baicalensis, как и всего рода и семейства Lamiaceae, отличаются наличием 2-метилированных и гликозидированных производных, которые относятся к группе редких дериватов флавона. Следует особо отметить присутствие 2,6-гидроксилированных, метоксилированных и гликозидированных флавонов, а также редких соединений с 3- и 5-замещением.

Tani Т. с соавторами в ходе изучения распределения флавонов S. baicalensis в разных частях растения установлено, что гликозиды (байкалин, вогонозид) концентрируются в основном во флоэме и ксилеме корня, а агликоны (байкалеин, вогонин) – в перидерме корня [191]. Общее содержание флавоноидов в корнях S.

baicalensis варьирует в зависимости от места произрастания и находится в пределах 5,19 – 22,82% [81]. Так, в работах Бухашеевой Т. Г. при изучении содержания флавоноидных соединений в 14 популяциях шлемника байкальского Забайкальского края установлено, что накопление флавоноидных соединений зависит от возрастного состояния растения, эколого-географического района произрастания, возраста и фазы вегетации [11].

Среди других соединений фенольной природы в корнях шлемника байкальского обнаружены представители флавонолов – кверцетин, рутин, висцидулин I и его 2-О-глюкозид, халконов – 2,6,2,4-тетрагидрокси-6метоксихалкон, изофлавонов – дайдзеин, дайдзин, пуэрарин и формононетин, лигнофлавоноидов – гедиотол С 4-О-глюкозид и гедиотол D 4-О-глюкозид, фенилпропаноидов – 2-(3-гидрокси-4-метокси-фенилэтил)-1-О-рамнозил-(4-Оферулоил)-глюкозид, актеозид, лейкоцепозид А, эритро-гваяцилглицерол-сирингарезинолового эфира 4-О-глюкозид [81]. Флавоноидам сопутствует сложный комплекс оксикоричных кислот. В корнях шлемника байкальского обнаружены кумарины, углеводы (СУ – 16,10%, ВРПС 1,08%, ПВ – 10,15%, Гц А

– 1,26%, Гц Б – 4,76%), сапонины (0,18%), дубильные вещества пирокатехиновой группы 6,2%, микро- и макроэлементы [11, 79, 128]. Дубильные вещества содержатся только в корнях, а эфирные масла - в листьях и стеблях (железистые волоски) [11, 135].

Корни шлемника байкальского содержат макроэлементы (мг/г): K – 10,60, Ca – 4,40, Mg – 8,40, Fe – 0,60; микроэлементы (КБН): Mn – 0,17, Cu – 0,88, Zn – 0,25, Cr – 0,09, Al – 0,43, Ва – 0,63, V – 0,17, Se – 0,95, Ni – 0,35, Sr – 0,51, Pb – 0,10, I – 0,10. B – 0,80 мкг/г; концентрируют Fe, Cu, Se [86].

В последние годы проведено изучение химического состава надземной части растения, выделено и идентифицировано около 20 флавоноидных соединений, содержание которых достигает 10% [135]. Основными компонентами являются скутеллареин, 7- глюкурониды апигенина и лютеолина, а также флаваноновые глюкурониды. Установлено, что в 5 популяциях шлемника байкальского, произрастающего в Забайкальском крае, содержание суммы флавоноидов в пересчете на скутеллярин составляет от 15,32 – 27,88%, суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид – 4,38 – 5,77%. [128]. Выявлено наличие кофейной, хлорогеновой, розмариновой, феруловой кислот и апигенина, а также антоциановых соединений (дельфинидин и его гликозиды) - 8,71%.

Углеводный комплекс надземной части шлемника байкальского представлен свободными углеводами (СУ) – 9,36 - 10,88%, водорастворимыми полисахаридами (ВРПС) – 1,28 - 2,15%, пектиновыми веществами (ПВ) – 3,78 гемицеллюлозами А (Гц А) – 3,12 – 5,88%, гемицеллюлозами Б (Гц Б) – 3,79 – 5,57%.

При исследовании азотсодержащих соединений надземной части S.

baicalensis обнаружено 14 свободных аминокислот: аланин, аспарагин, цистеин, глютамин, глутаминовая кислота, глицин, изолейцин, метионин, пролин, серин, треонин, валин, -аминомаслянная кислота и фосфоэтаноламин, доминирующими являются пролин, глицин, аспарагин. Общее содержание свободных аминокислот составляет 0,42 - 0,51%. После гидролиза основной состав аминокислот сохраняется, появляются аспарагиновая кислота, гистидин, лизин, фенилаланин, тирозин. Общее содержание алкалоидов составляет 0,33 - 0,36%.

Выделен комплекс органических кислот: винная, лимонная, яблочная, малоновая, янтарная, фумаровая и их общее содержание в различных популяциях составляет от 9,51 до 12,40%. Определено содержание БАВ в образцах 5 популяций: окисляемых веществ 10,89 – 24,94%, дубильных веществ 2,25 – 2,70%, общих липидов 1,10 – 1,89%, суммы тритерпеновых соединений в пересчете на урсоловую кислоту 0,32 – 0,42%, суммы каротиноидов в пересчете на -каротин 0,41 – 0,90%, хлорофилл а 2,12 – 2,93%, хлорофилл b 1,74 – 4,01%.

1.4.3. Корневища и корни вздутоплодника сибирского Вздутоплодник сибирский – Phlojodicarpus sibiricus (Steph. ex Spreng) K. – Pol. семейства сельдерейные (Apiaceae) – многолетнее травянистое горностепное растение, произрастающее на привершинной части сопок, наиболее характерно для нителистниковых степей. В РФ распространен в Забайкальском крае, Республике Бурятия, в Прибайкалье, встречается в Хакассии и Якутии, а также в Монголии [41, 84, 136].

В народной медицине Забайкалья корневищами и корнями вздутоплодника лечили пневмонии, туберкулез легких, нервные болезни, гастроэнтериты, дифтерию [7, 60, 68, 74].

Бурятские и монгольские ламы часто использовали данное растение как заменитель коктуса прекрасного в сложных лекарственных композициях [77]. Вздутоплодник сибирский популярен в якутской медицине, народное название «боро сиир ото» - «волчья ягода». Его издавна применяли как панацею от 40 болезней, главным образом от желудочно-кишечных, сердечнососудистых заболеваний, ревматизма, туберкулеза легких, заболеваний щитовидной железы, а также для лечения гнойных ран, порезов, панарициев,

–  –  –

Ph. villosus Turcz. [6, 73]. Позже, в 1969 г. Никоновым Г. К. и Вандышевым В. В. в корнях указанных выше 2 видов обнаружен виснадин [73]. В 1970 г. Ладыгиной Е. Я. проведено детальное изучение локализации виснадина и дигидросамидина в подземных органах вздутоплодника сибирского [58]. Автором установлено, что состав кумариновых веществ подземных органов данного вида – корня, гипокотиля и стеблекорня – одинаков и представлен 6 соединениями, из которых в количественном отношении преобладают виснадин и дигидросамидин.

Во всех подземных органах растения кумариновые соединения локализуются в секреторных каналах. Виснадин локализуется в содержимом этих каналов, а дигидросамидин – в их обкладочных (выделительных) клетках.

Кроме того, Пименовым М. Г., Бабилевым Ф. Б. установлено наличие кумаринов в корнях - до 4,5 %, листьях - 0,48 %, плодах - 0,66 %, соцветиях -0,34 % и стеблях - 0,08 % [20]. При дальнейшем исследовании из корневищ и корней растения Антоновой О. К. и Шемерянкиным Б. В. были выделены умбеллиферон и скополетин [3]. По мере накопления данных о химическом составе подземной части растения стали выделять 2 хеморасы вздутоплодника сибирского.

К первой хеморасе относили растения из юго-восточных районов Забайкальского края, которые содержат в основном пиранокумарины дигидросамидина и виснадина [16], хиноны [146] и кислоты (уксусная и изовалериановая), а также вздутоплодник из других мест произрастания, содержащий эфиры ксантогалола:

изобутират, изовалерианат, ангелат (ксантогалин), сенеционат (бухтармин) и диэфиры келлактона: диизовалерионат келлактона, птериксин, самидин, изосамидин [60]. Вторая хемораса отличалась значительно большим набором компонентов и большим их разнообразием: суксдорфин, 3'-ацетокси-4'изобутирилокси-3',4'-дигидросеселин, 3'-изовалерилокси-4'-ангелоилокси-3',4'дигидросеселин, 4'-ангелоилокси-4'-изовалерилокси-3',4'-дигидросеселин, аномалин, дельтоин, пранчигмин, изоимператорин [89, 114].

Благодаря проведенным фитохимическим [6, 28, 44, 48, 57, 58, 73, 75, 82, 84, 132] и ресурсоведческим [41, 84] исследованиям на основе корневищ и корней вздутоплодника сибирского были созданы отечественные препараты спазмолитического и коронарорасширяющего действия – димидин и фловерин [47].

Для оценки качества как самого вздутоплодника сибирского, так и препаратов из него, использовались различные методы. В. С. Кабановым В. С. и др. разработан газохроматографический метод количественного определения суммы виснадина и дигидросамидина в корневищах и корнях Ph. sibiricus с использованием стандарта – фловерина [47], а также метод определения соотношения этих компонентов в их смесях [48]. Новосельцевой Н. П. и др.

предложена хроматоспектрофотометрическая методика определения суммы этих веществ, в качестве стандартного образца применяли - димидин [75]. Виснадин и дигидросамидин отличаются между собой строением 4'-ацильной группы: первый ацилирован - метилмасляной, а второй – - метилмасляной кислотами (рисунок 4).

Рисунок 4- Химические структуры дигидросамидина (1) и виснадина (2)

Такая близость в строении сильно уравнивает химические и физические свойства этих веществ, поэтому возникают трудности при разделении веществ как в сырье, так и в препаратах из него [44, 47, 48]. Исследования в данном направлении велись Шейченко В. И., Вандышевым В. В. Они изучили строение виснадина методом Н-ЯМР-спектроскопии и пришли к заключению, что игольчатые кристаллы смеси состоят из четырех молекул виснадина и одной молекулы дигидросамидина, которые, образуют кристаллическую ячейку. С этим явлением и связана трудность получения виснадина в чистом виде [132].

Анализом химического состава надземной части вздутоплодника сибирского занимались Гантимур Д., Сырчина А. И. и Семенов А. А. [20, 21].

Ученые исследовали вздутоплодники Ph. sibiricus, Ph. villosus и Ph. turczaninovii трех популяций – даурской, якутской и окрестностей Улан-Батора. В результате проведенной работы авторами установлено, что состав кумаринов надземной части вздутоплодника сибирского не стабилен и зависит от места его произрастания. Так, основным кумарином растений, произрастающих в окрестностях Улан-Батора, является ломатин. Также обнаружены бухтармин, ксантогалин, умбеллиферон, биозид и флавоноид диосметин-7-О--Dглюкопиранозид. Кумариновый состав даурской популяции (Забайкальский край) представлен простыми и сложными эфирами келлактона: смесь эфиров цискеллактона-саксдорфина и 3-О-ацетил-4(2-метилбутаноата)-цис-келлактона (0,8%), цис- и транс-4 -О-метиловые эфиры келлактона. В растениях якутской популяции присутствуют смеси эфиров цис-келлактона-саксодорфина и 3-Оацетил-4(2-метилбутаноата) цис-келлактона, биозид, умбеллиферон, изоимператорин.

Фитохимические исследования вздутоплодника сибирского продолжаются и в настоящее время. Тараскиным В. В. из корневищ и корней данного вида, произрастающего в Республике Бурятия и Забайкальском крае, были выделены 6 производных кумарина (пеуцинидин, дигидроломатин, дигидросамидин, смесь цис- и транс-келлактонов, метилкеллактон) и определено содержание пироновых соединений - 2,66%. Из основных БАВ обнаружены: эфирные масла (0,5-1,4%), жирные кислоты (общее содержание жирного масла – 6,9%), рутин мкг/г), сахароза (5%), микроэлементы Основными (0,002-0,0032 [114].

составляющими эфирного масла из надземной части растений Ph. sibiricus являются гермакрен D (17,43-17,55%), спатуленол (7,35-7,98%), -терпинен (5,0диметиловый эфир тимогидрохинона (4,12-4,34%), n-цимол (4,04-4,26%).

Эфирное масло из подземной части Ph. sibiricus характеризуется нестабильностью количественного содержания его составляющих, как в пределах одной популяции (в разные годы), так и между популяциями (из разных районов произрастания).

Так, в эфирном масле из корневищ и корней растений, собранных в 2009 г.

основными компонентами являются ионол - 10,99%, диметиловый эфир тимогидрохигнона -10,45%, -кадинен - 0,53%, в 2008 г. - -терпинен - 37,86%, терпинолен - 30,1%, n-цимол - 9,35 %. Жирные кислоты корней и корневищ вздутоплодника сибирского представлены 21 кислотой, среди которых превалирующими являются - C18:0, С18:1n9, C18:2n6, 18:3n3, 20:2n11.

Изучен элементный состав корневищ и корней вздутоплодника сибирского Сu - 2,21-8,48 мг/кг, Zn – 20,30-41,90 мг/кг, Cd – 0, 17-0,29 мг/кг, Pb – 0,30-1,25 мг/кг, Ni - 1,52-5,85%, Mn – 26,90-58,11 мг/кг, Сr – 59,31-64,41 мг/кг.

Изучением состояния ценопопуляций вздутоплодника сибирского в Восточном Забайкалье в настоящее время занимается Гилева М. В. [22, 23, 24].

Ею изучена численность, возрастная и пространственная структура ценопопуляций вида, фенологические особенности в различных типах ассоциаций. Описаны ход онтогенеза, сезонный ритм развития, семенная и сырьевая продуктивность при выращивании в Забайкальском крае [14].

1.5. Сборы и экстракты сухие – оптимальные формы переработки лекарственного растительного сырья Сборы – одна из традиционных форм переработки растительного сырья, используемая человечеством с глубокой древности.

Изучение сборов является перспективным направлением фармацевтической науки в связи с их терапевтической ценностью (эффективность и мягкость действия, отсутствие нежелательных побочных эффектов даже при длительном применении), наличием в РФ достаточной сырьевой базы по многим видам растительного сырья, богатым опытом производства и клинического применения лекарственных средств растительного происхождения.

Обладая многочисленными положительными свойствами сборы тем не менее обладают определенными недостатками: при самостоятельном приготовлении водных извлечений в домашних условиях происходит неполное извлечение БАВ, отсутствует возможность контроля качества подобных препаратов, при хранении сборы расслаиваются, что приводит к нарушению соотношения входящих в него компонентов и, соответственно, дозировки препарата.

В связи с этим перспективным и рациональным подходом является перевод растительных композиций и официальных сборов в суммарные экстракционные препараты, содержащие максимальное количество экстрактивных и биологически активных веществ, необходимых для обеспечения фармакотерапевтического эффекта. Экстракты сухие являются одной из наиболее рациональных форм переработки лекарственного растительного сырья. Они находят широкое применение в фармацевтическом производстве, так как при их получении не нарушается стабильность соотношения и фармакологическая активность БАВ, а также значительно повышается качество переработки лекарственного растительного сырья. Эту лекарственную форму отличает точность дозирования, удобство применения, стойкость к микробной контаминации, достаточно длительный срок годности. Получение сухих экстрактов представляет интерес для разработок ресурсосберегающих технологий производства лекарственных средств растительного происхождения.

Совершенствование технологии получения растительных экстрактов направлено на наиболее полное извлечение из растительного сырья основных БАВ. В настоящее время при производстве экстрактов помимо традиционных методов экстрагирования лекарственного растительного сырья (реперколяция, противоточная и циркуляционная экстракция) все большую популярность приобретают интенсивные методы экстракции, характеризующиеся достижением большого выхода БАВ и ускорением процесса экстрагирования [38, 94].

При вихревой экстракции происходит вихревое перемешивание экстрагента и одновременное измельчение лекарственного растительного сырья с помощью турбинной или лопастной мешалки, вращающейся со скоростью 5000-13000 об/мин. При данном виде экстракции интенсификация массообменных процессов в турбулентном потоке экстрагента достигается за счет резкого уменьшения толщины диффузионного слоя на границе раздела фаз и многократно повторяющихся деформаций частиц растительного сырья. К недостаткам метода относятся повышение температуры при работе мешалок, ведущее к изменению свойств БАВ, улетучиванию экстрагента, и трудности очистки вытяжки от взвеси вследствие интенсивного измельчения лекарственного растительного сырья.

При обработке ЛРС с помощью ультразвука и инфразвука происходит ускорение процесса экстракции за счет следующих факторов: 1) увеличение границы раздела фаз за счет дисперсии частиц ЛРС; 2) частичное разрушение клеток растительного материала; создание максимальной разности 3) концентраций вследствие интенсивного перемешивания и возникновения конвективной диффузии; 4) тепловой эффект.

Основным достоинством метода является малая продолжительность экстракции. К недостаткам метода относятся дороговизна оборудования, высокую агрессивность ультразвука в отношении действующих веществ, т.е. разрушение молекул под действием гидродинамических ударов кавитации.

При электродинамической мацерации высоковольтный импульсный разряд вызывает сверхвысокие гидравлические давления порядка 108 - 1010 атм, и мощные кавитационные процессы. Этот метод перспективен, хотя и не лишен таких недостатков, как возможность разрушения молекул, создание высокого уровня шума за счет гидравлических ударов, высокая себестоимость продукта.

Центробежную экстракцию осуществляют с помощью фильтрующей центрифуги. За счет центробежных сил первичный сок удаляется из клеточного материала, на его место подается свежий экстрагент, который вновь удаляется из материала. Экстрагент циркулирует до насыщения, а затем заменяется новым.

Экстракция с воздействием электромагнитного поля повышает десорбцию веществ за счет снижения степени гидратации сольватации) молекул БАВ, вследствие чего происходит увеличение коэффициента свободной диффузии дегидратированных молекул и ускорение прохождения молекул через клеточные оболочки.

При экстракции под воздействием электрического тока ускоряется экстракция веществ, относящихся к электролитам.

При экстракции с электроимпульсным воздействием интенсификация массопереноса достигается с помощью высоковольтного разряда, образующегося в результате аккумулирования электрической энергии и ее выделения в короткие промежутки времени. Электрические разряды ускоряют течение внутриклеточной диффузии за счет возникновения конвективной диффузии и частичного разрушения клеточных оболочек.

Магнитоимпульсные аппараты имеют электропроводную мембрану, которая колеблется с частотой колебания магнитного поля и передает импульсное движение среде [37].

Экстракция сжиженными газами - один из новейших и перспективных способов экстракции ЛРС, содержащего летучие и неустойчивые вещества, такие как эфирные масла, сердечные гликозиды, фитонциды [94]. Экстрагентами выступают сжиженные газы бутан, азот, аммиак, оксид углерода (ІV), фреон, аргон. Поскольку сжиженные газы имеют температуру кипения ниже комнатной температуры, то окисления, разложения и потери БАВ при выпаривании не происходит. По химическим свойствам сжиженный оксид углерода (ІV) проявляет индифферентность по отношению к сырью, БАВ, материалам аппаратуры, пожаро- и взрывобезопасен. Количественный выход БАВ при экстрагировании сжиженными газами достигает 88-98%, что выше, чем у известных способов экстрагирования [61].

Выводы к главе 1

1. В настоящее время для лечения и профилактики цереброваскулярных заболеваний используют нейропротективные средства разнообразной химической структуры и происхождения. Растительные нейропротекторы, выгодно отличаясь от нейропротекторов синтетического происхождения отсутствием побочных эффектов, применяют чаще всего для уменьшения выраженности последствий отдаленной ишемии головного мозга.

2. Корни астрагала перепончатого, корни шлемника байкальского, корневища и корни вздутоплодника сибирского являются перспективными растениями для разработки на их основе эффективных нейропротекторов за счет их комплексного фармакологического действия.

3. Сухие экстракты являются оптимальной формой переработки растительного сырья и сборов, обеспечивающие необходимый фармакотерапевтический эффект.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования Объектами исследования служили образцы опытных партий сбора нейропротективного, экстракта сухого (условно названного «Брэйн-профит»), полученного на основе сбора, а также корни астрагала перепончатого, корни шлемника байкальского – ФС 42-453-91, корневища и корни вздутоплодника сибирского – ФС 42-2667-89. Сырье приобретено в ГАУЗ РКБ ВЛ «Центр Восточной Медицины», ПТ «Даурская заготовительная компания». Корни астрагала перепончатого собраны в различных районах Республики Бурятия и Забайкальском крае с 2008 по 2012 годы.

2. 2. Методы исследования Сборы готовили в соответствии с требованиями статьи «Сборы», ГФ XI изд., вып.1, с. 266 [26]. Измельчение воздушно-сухого сырья проводили согласно ГФ XI изд., вып.1, с. 285; отбор средней и аналитической проб – ГФ XI изд., вып.1, с. 273; изучение внешних признаков – ГФ XI изд., вып.1, с. 266-267;

изучение анатомических признаков – ГФ ХI изд., вып. 1, с. 277. Для экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем растворителей использовали реактивы марок «ч», «хч», «чда».

Определение экстрактивных веществ в сырье проводили по ГФ XI изд., вып. 1, с. 295; определение золы общей - по ГФ XII изд., ч. 1, с. 115 [27], золы, не растворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты - по ГФ XI изд., вып. 2, с.

24; определение тяжелых металлов в экстракте сухом - по ГФ XI изд., вып. 1, с. 160;

определение плотности отгона осуществляли по методу ГФ XI изд., вып. 1, с. 24.

Элементный состав определяли на масс-спектрометре с индуктивной плазмой «Elan 9000» (Perkin Elmer, США) согласно МУК 4.1.1483-03.

Количественное определение азота общего проводили фотоколориметрическим методом [67].

Качественный состав и количественное содержание аминокислот определяли на аминокислотном анализаторе ААА - 339 (Microtechina, Чехия).

Содержание аминокислот рассчитывали в нмоль/г и мг/г абсолютно сухого сырья/экстракта.

Методика пробоподготовки для анализа свободных аминокислот. Около 1 г (точная навеска) воздушно-сухого сырья/экстракта экстрагировали 80% спиртом при температуре кипения водяной бани в течение 30 минут. Экстракцию повторяли в течение 20 минут. Далее полученный супернатант упаривали до сухого состояния, растворяли в литий-цитратном буфере (рН 2,2) в объеме, определенном в зависимости от концентрации аминокислот.

Приготовление литий-цитратного буфера (рН 2,2): 14,1 г лития цитрата, 13,0 мл кислоты хлористоводородной концентрированной, 1,15 мл тиодигликоля, 0,05 мл каприловой кислоты растворяли в небольшом количестве воды и доводили водой объем раствора до 500 мл.

Методика пробоподготовки для анализа связанных аминокислот.

Связанные аминокислоты определяли после кислотного гидролиза 6 М хлористоводородной кислотой при температуре 110С в течение 24 часов в ампуле. После ампулу вскрывали, соляную кислоту упаривали на роторном испарителе, остаток растворяли в натрий - цитратном буферном растворе (рН 2,2).

Приготовление натрий-цитратного буфера (рН 2,2): 9,8 г натрия цитрата (дигидрата), 15,5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной, 2,5 мл тиодигликоля, 1 мл раствора детергента Brij-35(50 г/ 100 мл), 0,05 мл каприловой кислоты растворяли в небольшом количестве воды и доводили водой объем раствора до 500 мл.

Бумажная и тонкослойная хроматография Хроматографическое изучение веществ проводили методами восходящей хроматографии на бумаге марки FN-12 и FN-16 «Filtrak» и тонкослойной хроматографии на пластинах ПТСХ-П-А-УФ-254 «Sorbfil» и «Silufol UV254».

Очистку пластин «Silufol UV254» выполняли с помощью ацетона. Подготовку платин ПТСХ-П-А-УФ-254 «Sorbfil» проводили путем прогревания пластин при температуре 110°С в течение 1 часа.

В качестве подвижных фаз использовали следующие системы растворителей:

15 % кислота уксусная;

1.

н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2);

2.

этилацетат-ледяная уксусная кислота (80:20);

3.

этанол-уксусная кислота: вода (90:9:1);

4.

гексан- бензол-метанол (5:4:1);

5.

хлороформ-этанолол (9:1);

6.

бензол-этилацетат (2:1);

7.

хлороформ-метанол (60:40);

8.

н-бутанол-95% спирт-раствор аммиака (7:2:5).

9.

Хроматографирование выполняли в соответствующих системах растворителей при температуре 19-23oС в закрытых стеклянных камерах. Все величины Rf обнаруженных соединений являются средними из пяти измерений.

При проведении методик качественного и количественного определения биологически активных веществ использованы хроматографически чистые вещества и стандарты: ГСО рутина – ФС 42-2508-87, ВИЛАР ТУ 9369-141– 048668244-02; ГСО гиперозида – ФС 42-0106-03; ГСО кверцетина – ФС 42-290ВИЛАР ТУ 9369-128-04868244-03; ГСО лютеолина – ФС 42-3130-95;

мирицетин («свидетель, ч.»); гесперидин – Sigma, кат. № H5254; ГСО лютеолингликозида – ФС 42-3130-95; байкалин – Sigma, кат. № 572667, кислота кофейная

– Sigma, кат. № C0625; хлорогеновая кислота – Sigma, кат. № C3878; феруловая кислота СО – ТУ 9369-143-0486244-01, апигенин - Fluka, кат. №10748, галловая кислота – Fluka, кат. №48630; кислота коричная – ГОСТ 15057-79; кислота яблочная – ТУ 6-09-4058-75; ГСО кислоты аскорбиновой - ФС 42-2668-95;

кислота лимонная – ГОС 3652-89; ГСО глюкозы (ФС 42-2419-86), скополетин Sigma, кат. № S2500, умбеллиферон - Sigma, кат. № H24003, ГСО фловерина ФС 42-2532-88, олеаноловая кислота - Sigma, кат. № O5504, предоставленные ВИЛАР (г. Москва).

Приготовление растворов стандартных образцов и реактивов для спектрофотометрических и хромато-спектрофотометрических методик количественного определения:

Приготовление раствора РСО байкалина: Около 0,015 г (точная навеска) байкалина помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 2 мл ДМСО, доводили объем раствора до метки 60% спиртом и перемешивали (раствор А). 2 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем раствора до метки 60% спиртом и перемешивали.

Приготовление раствора РСО аргинина: Около 0,025 г (точная навеска) аргинина помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 40-50 мл воды очищенной, доводили объем раствора до метки водой и перемешивали (раствор Б).

Приготовление раствора РСО аспарагина: Около 0,05 г (точная навеска) аспарагина помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 40-50 мл 10% спирта, доводили объем раствора до метки 10% спиртом и перемешивали (раствор Б).

Приготовление раствора РСО аскорбиновой кислоты: Около 0,05 г (точная навеска) кислоты аскорбиновой (ГОСТ 7047-55), высушенной до постоянной массы при температуре 100°С, растворяли в 90 мл воды очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводили объем раствора водой до метки и перемешивали (раствор А). 5 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем водой до метки и перемешивали.

Приготовление фосфорномолибденового реактива для количественного определения аскорбиновой кислоты методом спектрофотометрии: 0,05 г натрия фосфата растворяли в 100 мл воды в мерной колбе 200 мл, после растворения прибавляли 10 мл серной кислоты концентрированной, затем прибавляли 0,8 г аммония молибдата.

Приготовление раствора РСО глюкозы. Около 0,1 г (точная навеска) глюкозы (ФС 42-2419-86), предварительно высушенной при температуре 100С до постоянной массы, растворяли в воде в мерной колбе вместимостью 250 мл, доводили объем раствора водой очищенной до метки и перемешивали.

Приготовление раствора РСО олеаноловой кислоты: Около 0,0025 г (точная навеска) олеаноловой кслоты помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в 15 - 20 мл 95% спирта, доводили раствор до метки 95% спиртом, перемешивали.

Приготовление раствора ГСО фловерина: Около 0,05 г (точная навеска) фловерина помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 30-40 мл 95% спирта, доводили раствор 95% спиртом до метки, перемешивали.

Приготовление растворов сравнения для ВЭЖХ-анализа:

Приготовление растворов сравнения для ВЭЖХ-анализа фенольных соединений: по 0,015 рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, геспередина, апигенина, гиперозида, дигидрокверцетина, кемпферола, витексина, изовитексина, нарингенина, байкалина, изорамнетина галловой кислоты, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, цикориевой кислоты, коричной кислоты, феруловой кислоты, эллаговой, о-кумаровой, умбеллиферона, эскулетина, кумарина, метоксикумарина, эпигалокатехингаллата, эпикатехина, даидзеина помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяли в 50 мл 70% спирта, доводили объёмы растворов до меток тем же растворителем и перемешивали. Срок годности растворов - 3 месяца.

Приготовление растворов сравнения для ВЭЖХ-анализа свободных углеводов и органических кислот:

1. По 0,60 г рамнозы, ксилозы, мальтозы, сорбитола, глюкозы, лактозы, арабинозы, сахарозы, фруктозы, галактозы помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяли каждый стандартный образец в 25 мл 0,05 М раствора серной кислоты и доводили тем же растворителем до меток, перемешивали.

2. По 0,025 г аскорбиновой, лимонной, щавелевой, яблочной, янтарной, винной, фумаровой кислот помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяли каждый стандартный образец в 25 мл 0,05 М раствора серной кислоты и доводили тем же растворителем до меток, перемешивали.

Приготовление растворов сравнения для ВЭЖХ-анализа кумаринов: 10 мг стандартного образца (умбеллиферона, скополетина, пеуцинидина, фловерина) растворяли в мерной колбе вместимостью 50 мл в 70% спирте, перемешивали (раствор А с концентрацией 0,2 мг/мл). 2,5 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили объема раствора до метки 70 % спиртом (раствор Б с концентрацией 0,01 мг/мл).

Приготовление растворов сравнения для ВЭЖХ-анализа углеводов (при исследовании углеводных фракций корней астрагала перепончатого):

По 0,6 г рамнозы, ксилозы, мальтозы, глюкозы, лактозы, арабинозы, сахарозы, фруктозы, галактозы, маннозы и сорбита помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяли каждый стандартный образец в 25 мл воды очищенной и доводили тем же растворителем до меток, перемешивали.

Электронные спектры соединений в УФ- и видимой областях регистрировали на приборах CФ-2000 (АОЗТ «ОКБ СПЕКТР», Россия) и ПЭ-5400 УФ (ООО «Экохим», Россия) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см.

Спектрофотометрическое определение БАВ проводили с помощью спектрофотометра CECIL CE 2011 (СECIL INSTRUMENTS, Англия) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 cм.

ВЭЖХ - анализ фенольных соединений проводили на жидкостном хроматографе «GILSTON», модель 305 (GILSTON, Франция), инжектор ручной «Rheodyne», модель 7125 (Rheodyne, США) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования программой «Мультихром» для «Windows». Колонка - 250,46 см с октадецилсилил силикагелем (Kromasil C 18), 5 мкм. Подвижная фаза – метанол – вода – фосфорная кислота (концентрированная) (40:60:0,5). Температура колонки - 25С. Скорость потока – 0,8 мл/мин. Детектор - спектрофотометрический «GILSTON» UV/VIS, модель 131, 254 нм. Объем пробы - 50 мкл. Продолжительность анализа 90 минут.

ВЭЖХ - анализ свободных углеводов и органических кислот проводили на жидкостном хроматографе «GILSTON», модель 305 (GILSTON, Франция), инжектор ручной «Rheodyne», модель 7125 (Rheodyne, США) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования программой «Мультихром»

для «Windows». Колонка - 300,65 см с сульфированным сополимером стиролдивинилбензола (ALTECH OA-1000 Organic Acids), 9 мкм. Подвижная фаза

– 0,05 М раствор серной кислоты. Температура колонки - 65С. Скорость потока – 0,8 мл/мин. Детектор - спектрофотометрический «GILSTON» UV/VIS, модель 131, 190 нм. Объем пробы - 20 мкл. Продолжительность анализа 30 минут.

Количественное определение кумаринов проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Agilent 1200» (Agilent Technologies, США). Колонка см с октадецилсилил силикагелем (Zorbax Eclipse XDB C18), 5 мкм.

Подвижная фаза – А: 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, В: 100% ацетонитрил. Элюирование проводили в градиентном режиме (таблица 1).

Таблица 1 – Программа градиентного элюирования для ВЭЖХ-МС-анализа кумаринов

–  –  –

Скорость потока – 1,0 мл/мин. Детектор тандемный массспектрометрический «ионная ловушка» 6330, способ ионизации - электроспрей.

Объем пробы - 10 мкл. Продолжительность анализа - 30 минут. Анализ проводился в режиме регистрации отрицательных ионов, по полному ионному току TIC, по массовым зарядам характеристических (МS) и дочерних (МS2) отрицательных ионов. Режим UltraScan 50-1300 m/z, AutoMS. Количественный и качественный анализ проводили по извлеченным хроматограммам с использованием рабочих стандартных образцов кумаринов - умбеллиферона, скополетина, пеуцинидина, фловерина (суммы дигидросамидина и виснадина).

Состав углеводных фракций после кислотного гидролиза (2 М Н2SO4) определяли на высокоэффективном жидкостном хроматографе WellChrom (Knauer, Германия) с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Мультихром». Колонка - 300,78 см с сульфированным сополимером стиролдивинилбензола в свинцовой форме (Rezex RPM Monosaccharide), 8 мкм. Подвижная фаза - вода. Температура колонки - 80°С.

Скорость потока - 0,6 мл/мин. Детектор – рефрактометрический. Объем пробы мкл.

Количественное определение витаминов группы В и свободных углеводов проводили с использованием методик, разработанных группой компаний «ЛЮМЭКС»:

Методика измерений содержания свободных форм

1) M 04-72-2011.

водорастворимых витаминов в премиксах, витаминных концентрах, смесях и добавках, в том числе жидких, методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза "КАПЕЛЬ-105/105М".

2) М 04-69-2011. Напитки. Плодоовощная продукция. БАД. Мед. определение фруктозы, глюкозы и сахарозы методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза "КАПЕЛЬ 105/105М".

Для количественного определения витаминов группы В использовали навески растительных объектов по 0,2 г (степень измельчения 1 мм) и пробоподготовку проводили как для премиксов (ввиду большого содержания аминокислот в объектах), для количественного определения фруктозы, глюкозы и сахарозы - навески по 5,0 г (степень измельчения 1 мм) [53].

Компонентный состав эфирного масла определяли на газовом хроматографе Agilent 6890 (Agilent Technologies, США) с квадрупольным масс-спектрометром (HP MSD 5973N) в качестве детектора.

Использовалась 30-метровая кварцевая колонка НР-5MS с внутренним диаметром 0,25 мм (неподвижная фаза фенил-:

диметилполисилоксан 5:95). Газ-носитель – гелий (постоянный поток 1,0 мл/мин).

Температура колонки: 50°С (изотерма 2 мин.), 50-200°С (4°С/мин.), 200-280°С (20°С/мин.), 280°С (изотерма 5 мин.), температура испарителя 250°С. Объём пробы 1 мкл раствора с разделением потока 50:1. Ионизация: электронный удар (70 эВ). Диапазон сканирования 5-550 а.е.м. Процентный состав эфирных масел вычисляли по площадям газо-хроматографических пиков с помощью программы MSD Cem Analize, без учёта корректирующих коэфициентов.

Компонентный состав фракции общих липидов идентифицировали на газовом хроматографе Agilent 6890 (Agilent Technologies, США) с квадрупольным масс-спектрометром (HP MSD 5973N) в качестве детектора.

Использовалась колонка НР-5MS с внутренним диаметром 0,25 мм (неподвижная фаза фенил-:

диметилполисилоксан 5:95). Газ-носитель – гелий (постоянный поток 1,0 мл/мин.). Температура колонки: 120°С (изотерма 4 мин.), 120-320°С (4°С/мин.), 165-225°С (изотерма 3 мин.), температура испарителя – 280°С. Объём пробы – 1 мкл раствора с разделением потока 60:1. Ионизация: электронный удар (70 эВ).

Диапазон сканирования 50-550 а.е.м. Качественный анализ основан на сравнении времен удерживания, полных масс-спектров библиотеки хромато-массспектрометрических данных летучих веществ растительного происхождения Процентный состав смеси вычисляли по площадям [116].

газохроматографических пиков без использования корректирующих коэффициентов. Качественный анализ основан на сравнении времен удерживания и полных масс-спектров соответствующих соединений (FAME Supelco 37 comp;

FAME Mix 10 mg/ ml in CH2Cl2).

Для извлечения липидов из растительного сырья применяли модифицированный метод Блайя и Дайэра [199].

Методика. 100 г измельченного сырья просеивали сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм, заливали 300 мл смеси хлороформ-метанол (1:2).

Смесь гомогенизировали в течение 2 минут в гомогенизаторе с ножами.

Гомогенат фильтровали под вакуумом, оставшуюся на фильтре шрот повторно гомогенизировали в смеси 300 мл хлороформ-метанол (1:2) и 80 мл воды.

Гомогенат фильтровали, остаток промывали на фильтре 150 мл смеси хлороформметанол. К объединенному экстракту прибавляли 250 мл хлороформа и 290 мл воды. После расслоения фаз хлороформный слой разбавляли бензолом и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в 25 мл хлороформа и в случае необходимости осветляли центрифугированием.

Получение метиловых эфиров жирных кислот с применением 2 М HCl в метиловом спирте: к аликвоте общих липидов 1 мг добавляли 1 мл раствора 2 М HCl в метиловом спирте. Омыление проводили 2 часа при температуре 90°С.

Полученный раствор, выпаривали током аргона. Далее к реакционной смеси

–  –  –

ГЛАВА 3. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРНЕЙ

АСТРАГАЛА ПЕРЕПОНЧАТОГО

Астрагал перепончатый широко используется в традиционной китайской и японской медицине. В ИОЭБ СО РАН проводилось изучение химического состава надземной части астрагала перепончатого, произрастающего в Республике Бурятия, Тангановой Е. А [113]. Установлено, что содержание суммы флавонодов составляет 1,22±0,06%, дубильных веществ – 1,78±0,07%, суммы аминокислот – 9,27±0,29%, аскорбиновой кислоты – 1,78±0,05%, свободных органических кислот

– 9,81±0,15%, суммы восстанавливающих моносахаров – 0,73±0,02%. Составлен проект ФС на траву астрагала перепончатого. Также имеются данные о сырьевых ресурсах растения [98], но корни данного растения в настоящее время не используются в официнальной медицине РФ, поэтому нами проведено фармакогностическое изучение корней астрагала перепончатого.

3.1. Характеристика морфологических признаков сырья Цельное сырье. Корни стержневые, ветвистые до 4 см толщиной, длиной 30см, расширяющиеся в верхней части, сильно одревесневшие, волокнистые, поверхность продольно-морщинистая, от серовато-желтого до желтоватобежевого цвета. На поперечном срезе видны светлая желтоватая внешняя кора, светло-желтая ксилема в виде сердцевинных лучей в корнях малого размера или в виде трещин в корнях большего размера, а также серовато-коричневый камбий, иногда видна коричневая сердцевина. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения сладковато - горький.

Измельченное сырье. Кусочки корней различной формы, проходящие сквозь сито диаметром 7 мм. Цвет желтовато-белый, желтовато-серый. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения сладковато - горький.

Порошкованное сырье. Измельченное сырье, проходящее сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм. Цвет бежевый. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения сладковато - горький.

3.2. Характеристика микроскопических признаков сырья При микроскопическом исследовании корней астрагала перепончатого, собранных в различных районах Республики Бурятия и Забайкальском крае, выявлены характерные анатомо-диагностические признаки сырья (поперечный срез корня и порошкованное сырье, рисунки 5 и 6).

Корни имеют вторичное беспучковое строение. На поперечных срезах видна хорошо развитая многорядная пробка, которая совместно с 3 - 5 рядами колленхимы образует феллодерму. Камбиальный пояс сплошной, многорядный, хорошо различим на срезах. Флоэмные лучи часто изогнуты и потрескавшиеся вдоль внешней части с волокнами, находящимися в виде пучков. Сердцевинные лучи 2 - 5-рядные. Просветы сосудов различного диаметра. В корнях присутствуют волокна, бесцветные или оранжевато-желтого цвета, с характерными утолщеными стенками, продольными трещинами и щеткообразными кончиками, расположены группами или одиночно в коровой и древесной частях корня. Каменистые клетки изодиаметрической или вытянутой формы с утолщенными, бороздчатыми стенками и простыми углублениями, встречаются в феллодерме. Клетки коры, древесины и сердцевины содержат простые крахмальные зерна (при обработке микропрепаратов раствором йода крахмальные зерна приобрели фиолетовое окрашивание).

Порошкованное сырье. Для микроскопии порошка корней астрагала перепончатого характерно: обрывки паренхимы, состоящей из округлых или округло-прямоугольных клеток; обилие механических волокон в плотных или расщепленных группах с разной степенью одревеснения, с продольной морщинистостью и редкими, едва заметными порами; обрывки сетчатых сосудов древесины диаметром 7 - 50 мкм, одиночные, в группах или прикрепленные к волокнам, редко - небольшие группы округлых или слегка удлиненных каменистых клеток с разной степенью одревеснения клеточных стенок; обрывки пробки коричневого цвета, состоящей из прямоугольных клеток, крахмальные зерна мелкие, нехарактерные, округлые, одиночные или в группах по 2 - 3.

А Б В Г Д Рисунок 5 - Микроскопическое строение поперечного среза корня астрагала перепончатого (А – увеличение 4х10, Б, В, Г, Д – увеличение 40х10, 1 – клетки пробки, 2 – колленхима, 3 – паренхима коры, 4 - флоэмные лучи, 5 – камбий, 6 – сердцевинные лучи, 7 – сосуды ксилемы, 8 – крахмальные зерна, 9 – механические волокна древесины) Ж Е З И Рисунок 6 - Микроскопическое строение порошка корней астрагала перепончатого (Е – увеличение 4х10, Ж, З, И - увеличение 10х10, 1 – паренхима, 2 – механические волокна, 3

– клетки пробки, 4 – сетчатые сосуды ксилемы)

–  –  –

В результате проведенного анализа обнаружено, что в различных образцах корней астрагала перепончатого содержание влажности составило от 5,81% до 6,43%, экстрактивных веществ, извлекаемых водой, от 20,98% до 25,12%, золы общей от 3,61% до 9,69%, золы, не растворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, от 0,90% до 5,07%, органических примесей от 0,25% до 0,39%, минеральных примесей от 0,50% до 0,74%.

На основании полученных данных предложены числовые показатели для корней астрагала перепончатого: влажность не более 8,0%; экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 20,0%, золы общей не более 10,0%; золы, не растворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 6,0%;

органических примесей не более 0,5%; минеральных примесей не более 1,0%.

Золу общую, полученную при проведении товароведческого анализа, использовали для определения элементного состава корней астрагала перепончатого (таблица 3).

Таблица 3 – Элементный состав корней астрагала перепончатого

–  –  –

Установлено наличие 28 макро- и микроэлементов в корнях астрагала перепончатого методом эмиссионного спектрального анализа. Макроэлементы представлены K – 0,51%, Ca – 0,25%, Р – 0,15%, Mg – 0,11% и Na – 0,005%. Cреди микроэлементов преобладают Fe – 168,90 мг/кг, Mn – 14,70 мг/кг, B – 13,80 мг/кг.

Содержание азота общего, определенного фотоколориметрическим методом, составило 2,30%.

3.4. Фитохимическое изучение корней астрагала перепончатого 3.4.1. Качественный анализ Нами проведено фитохимическое исследование извлечений из корней астрагала перепончатого на присутствие основных групп биологически активных веществ по общепринятым методикам, результаты исследования представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты качественного анализа извлечений корней астрагала перепончатого

–  –  –

Качественный анализ извлечений корней астрагала перепончатого показал наличие в сырье аминокислот, флавоноидов, дубильных веществ (конденсированных), кумаринов, тритерпеновых сапонинов, углеводного комплекса, катехинов, белковых веществ и алкалоидов.

3.4.2. Идентификация фенольных соединений методом ВЭЖХ Проведен анализ водно-спиртового извлечения корней астрагала перепончатого методом ВЭЖХ на присутствие веществ фенольной природы.

Методика приготовления 70% спиртового извлечения корней астрагала перепончатого. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм.

Около 2 г (точная навеска) измельченного сбора помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 20 мл 70% спирта, присоединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили 70% спиртом до метки (исследуемый раствор).

По 50 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали по выше приведенной методике (глава 2, п. 2.

2, с. 47). Результаты проведенных исследований приведены на рисунке 7 и в таблице 5.

–  –  –

Количественное определение аскорбиновой кислоты, эпигаллокатехин галлата, лютеолин-7-гликозида в корнях астрагала перепончатого методом ВЭЖХ Методика: Около 1,5 г (точная навеска) корней астрагала перепончатого (степень измельчения 2 мм) помещали в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл, приливали 50 мл 70% спирта, присоединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили 70% спиртом до метки (исследуемый раствор). Параллельно готовили растворы РСО аскорбиновой кислоты, лютеолин-7-гликозида, эпигаллокатехингаллата в 70% спирте. Для этого около 0,035 г (точная навеска) эпигаллокатехингаллата, 0,13 г аскорбиновой кислоты, 0,32 г лютеолин-7-гликозида помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, прибавляли 25 мл 70% спирта, перемешивали до растворения и доводили объёмы растворов до меток тем же растворителем. 4 мл полученного раствора (для аскорбиновой кислоты) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили до метки 70% спиртом (РСО). По 50 мкл исследуемого раствора и растворов РСО вводили в хроматограф и хроматографировали по выше приведенной методике (глава 2, п. 2.2, с. 47).

Расчёт количественного содержания аскорбиновой кислоты, лютеолин-7гликозида и эпигаллокатехингаллата производили методом абсолютной калибровки с помощью компьюторной программы «Мультихром» для «Windows»

используя формулу:

S ис Сстандарта100 100 100 С% S стандарта100 а (100 W ) где S ис - площадь пика соответствующего компонента в испытуемом растворе;

Sстандарта –площадь пика РСО аскорбиновой кислоты, лютеолин-7-гликозида, эпигаллокатехингаллата;

С% - концентрация соответствующего компонента, %;

Сстандарта - концентрация РСО аскорбиновой кислоты, лютеолин-7-гликозида, эпигаллокатехингаллата;

а – масса сырья, г;

W – влажность сырья, %.

Результаты проведенного анализа приведены в таблице 6.

Таблица 6 – Содержание БАВ в корнях астрагала перепончатого, определенных методом ВЭЖХ

–  –  –

В результате проведенного исследования в корнях астрагала перепончатого обнаружены флавоноиды лютеолин-7-гликозид, рутин, (дигидрокверцетин, кемпферол, нарингенин, катехин, эпигаллокатехингаллат, эпикатехин), оксикоричные (о-кумаровая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, неохлорогеновая, феруловая, изоферуловая), галловая, коричная, аскорбиновая кислоты, дубильные вещества (таннин) и кумарины (кумарин, о-метоксикумарин).

Количественно определено содержание лютеолин-7-гликозида – 0,006%, эпигаллокатехингаллата – 0,193%, аскорбиновой кислоты – 0,019%.

3.4.3. Обнаружение олеаноловой кислоты методом ТСХ Качественное определение олеаноловой кислоты проводили в системе 12 на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil». 0,05 мл 95% спиртового извлечения корней астрагала перепончатого (1:10) наносили микропипеткой на линию старта пластинки и хроматографировали в соответствующй системе параллельно с достоверным образцом олеаноловой кислоты. Хроматограммы высушивали на воздухе, обрабатывали 20% спиртовым раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, нагревали в сушильном шкафу при температуре 100°С в течение 5 - 10 минут и наблюдали розово-красное пятно на белом фоне пластинки на уровне пятна РСО олеаноловой кислоты Rf ~ 0,70 (рисунок 8).

Рисунок 8 - Схема хроматограммы 95% спиртового извлечения (1:10) корней астрагала перепончатого (1) и 95% спиртового раствора олеаноловой кислоты (2) в системе н-бутанол спирт - раствор аммиака (7:2:5) после обработки хроматограммы 20% спиртовым раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты

–  –  –

В результате проведенного исследования определены 17 свободных и 19 связанных аминокислот, среди них 9 незаменимых аминокислот (треонин, метионин, изолейцин, лейцин, лизин, гистидин, аргинин, валин, фенилаланин).

Суммарное содержание свободных аминокислот в сырье составляет 7,09 мг/г. В наибольшем количестве присутствуют аспарагин – 31,60%, аргинин – 27,11%, глютамин – 21,27% и глутаминовая кислота – 10,14% (от общего количества аминокислот). Суммарное содержание связанных аминокислот – 47,93 мг/г, среди которых преобладают пролин – 15,75%, глутаминовая кислота – 13,65 %, аспарагиновая кислота – 12,98%, гистидин – 10,68 % и аргинин – 10,22 % (от общего количества аминокислот).

3.4.5. Изучение жирных кислот корней астрагала перепончатого Для выделения общих липидов из корней астрагала перепончатого применяли модифицированный метод Блайя и Дайэра [199]. Анализ метиловых эфиров проводили методом ГХ-МС (рисунок 9).

Рисунок 9 - Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот корней астрагала перепончатого (1 – пальмитиновая кислота, 2 – олеиновая кислота, 3 – линолевая кислота, 4 – -линоленовая кислота) Таблица 8 – Состав жирных кислот корней астрагала перепончатого

–  –  –

Результаты исследования компонентного состава общих липидов, выделенных из корней астрагала перепончатого, и процентное содержание жирных кислот представлены в таблице 8 и на рисунке 9. Обнаружено 11 соединений – насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, их производные.

Выявлено наибольшее содержание ненасыщенных - линолевой, линоленовой, олеиновой и насыщенных - пальмитиновой кислот.

3.4.6. Изучение углеводного комплекса корней астрагала перепончатого Для выделения углеводного комплекса корней астрагала перепончатого выполняли последовательную экстракцию сырья водой очищенной, смесью 0,5% растворов аммония оксалата и щавелевой кислоты и 10% раствором натрия гидроксида и осаждение спиртом [56, 65]. Количественное содержание отдельных углеводных фракций определяли после высушивания гравиметрическим методом.

Для определения состава фракций проводили их предварительный гидролиз серной кислотой (1 моль/л) [10, 112]. Состав полученных гидролизатов (для свободных углеводов использовали водный раствор с концентрацией 20 мг/мл без кислотного гидролиза) определяли методом ВЭЖХ (глава, п. 2.2, с. 48).

В результате получены фракции: водорастворимые полисахариды (ВРПС) – 8,32%, пектиновые вещества (ПВ) – 7,02%, гемицеллюлозы А (Гц А) – 13,17%, гемицеллюлозы Б (Гц Б) - 2,12%. Содержание свободных углеводов (СУ), определенных антронным методом [80], соcтавляет 9,23%. Следует отметить, что выделенные фракции давали фиолетовое окрашивание с раствором йода, что указывает на присутствие в корнях астрагала перепончатого глюкана типа крахмала. Компонентный состав СУ: мальтотриоза - 87,3%, ксилоза - 10,0% и манноза - 2,7% (рисунок 10) Рисунок 10 - Хроматограмма свободных углеводов (СУ) углеводного комплекса корней астрагала перепончатого ВРПС представляли собой белый аморфный порошок, растворимый в воде, в водных растворах кислот и щелочей, но не растворимый в органических растворителях, осаждается спиртом и ацетоном. После кислотного гидролиза данный комплекс давал положительную реакцию с реактивом Фелинга.

Компонентный состав фракции после гидролиза: глюкоза - 94,0%, мальтоза – 2,7%, полимер - 0,2% (рисунок 11).

Рисунок 11 - Хроматограмма водорастворимых полисахаридов (ВРПС) углеводного комплекса корней астрагала перепончатого (после гидролиза) ПВ представляли собой светло-бежевый аморфный порошок, растворимый в воде. Водные растворы ПВ осаждались 1% Al2(SO4)3 c образованием пектатов.

Компонентный состав фракции после гидролиза: манноза - 99,2%, глюкоза - 0,8 % (рисунок 12).

Рисунок 12 - Хроматограмма пектиновых веществ (ПВ) углеводного комплекса корней астрагала перепончатого (после гидролиза) Гц А представляли собой светло-коричневый аморфный порошок.

Компонентный состав фракции после гидролиза: мальтоза – 74,0%, глюкоза – 12,0%, ксилоза – 4,4%, полимер – 6,6% (рисунок 13).

Рисунок 13 - Хроматограмма гемицеллюлоз А (Гц А) углеводного комплекса корней астрагала перепончатого (после гидролиза) Гц Б представляют собой светло-бежевый аморфный порошок.

Компонентный состав фракции после гидролиза: мальтоза - 56,5%, глюкоза – 28,0%, ксилоза – 4,8%, манноза – 2,3%, галактоза – 0,4%, полимер – 3,0% (рисунок 14).

Рисунок 14 - Хроматограмма гемицеллюлоз Б (Гц Б) углеводного комплекса корней астрагала перепончатого (после гидролиза) 3.4.7. Количественное определение тритерпеновых сапонинов в корнях астрагала перепончатого Значимой группой в химическом составе корней астрагала перепончатого являются тритерпеновые сапонины, влияющие на фармакологическую активность данного растения [150, 175, 189, 216]. Определение суммарного содержания тритерпеноидов проводили спектрофотометрическим методом с использованием галохромной реакции с серной кислотой концентрированной (рисунок 15). За основу взята методика количественного определения сапонинов в корневищах аралии маньчжурской в пересчете на олеаноловую кислоту [99].

Методика. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Около 4 г сырья (точная навеска) измельченного сырья пятикратно (по 30 минут) экстрагировали 95% спиртом порциями по 50 мл на кипящей водяной бане в плоскодонной колбе вместимостью 250 мл с обратным холодильником.

Полученные извлечения фильтровали и объединяли в мерную колбу вместимостью 250 мл (раствор А), недостающий объем восполняли экстрагентом.

Далее из полученного извлечения отбирали аликвоту объемом 20 мл, помещали ее в коническую колбу вместимостью 100 мл, выпаривали раствор на кипящей водяной бане досуха, к полученному сухому остатку добавляли 10 мл смеси для гидролиза (ледяная уксусная кислота – хлористоводородная кислота концентрированная – вода 3,5:1:5,5) и проводили гидролиз на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч с момента закипания бани. После кипячения гидролизную смесь разбавляли водой в 2 раза, выпавший осадок отделяли фильтрованием и промывали его многократно водой. Далее осадок на фильтре растворяли в 25 мл горячего 95% спирта и собирали в мерной колбе вместимостью 25 мл (раствор Б). К 1 мл раствора Б прибавляли 4 мл серной кислоты концентрированной, выдерживали 10 минут и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 310±2 нм (для получения спектра измеряли оптическую плотность в области 220-450 нм), раствор сравнения – серная кислота концентрированная. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора РСО олеаноловой кислоты в аналогичных условиях эксперимента. Полученные спектры продуктов реакции суммы тритерпеновых сапонинов астрагала перепончатого и стандарта олеаноловой кислоты с серной кислотой представлены на рисунке 15.

0,5 0,45 0,4

–  –  –

Рисунок 15 - Спектры продуктов взаимодействия сапонинов с серной кислотой концентрированной: 95% спиртового извлечения корней астрагала перепончатого и раствора РСО олеаноловой кислоты.

–  –  –

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 – оптическая плотность раствора РСО олеаноловой кислоты;

m – масса сырья, г;

m0 – масса РСО олеаноловой кислоты, г;

W – влажность сырья, %.

Метрологические характеристики методики приведены в таблице 9.

–  –  –

Таким образом, содержание тритерпеновых сапонинов в корнях астрагала перепончатого составляет 1,51±0,04%.

3.4.8. Количественное определение суммы органических кислот и дубильных веществ в корнях астрагала перепончатого Определение содержания суммы органических кислот проводили титриметрическим методом в пересчёте на яблочную кислоту по методике ГФ ХI изд., вып.1, ст. 38 [26], количественное определение дубильных веществ перманганометрическим методом в пересчёте на таннин по методике ГФ ХI изд., вып.1, с. 286 [26] (таблица 10).

Таблица 10 - Метрологические характеристики методик количественного определения суммы органических кислот и дубильных веществ в корнях астрагала перепончатого

–  –  –

Таким образом, содержание суммы органических кислот и дубильных веществ в корнях астрагала перепончатого составляет 1,96±0,03% и 0,44±0,02% соответственно.

Проведенные исследования показали, что корни астрагала перепончатого являются источником разнообразных БАВ. В таблице 11 приведены полученные данные по химическому составу корней астрагала перепончатого, произрастающего в различных районах Республики Бурятия и Забайкальском крае, и данные по химическому составу корней астрагала перепончатого, приведенные в литературе.

Таблица 11 – Сведения по химическому составу корней астрагала перепончатого, полученные в экспериментальной работе, и приведенные в литературе

–  –  –

Таким образом, полученные данные по химическому составу корней астрагала перепончатого, произрастающего в различных районах Республики Бурятия и Забайкальском крае, согласуются с данными, приведенными в литературе. Отмечено высокое содержание свободных и связанных аминокислот в корнях астрагала перепончатого, что учитывалось при стандартизации исследуемого растительного сырья.

3.5. Стандартизация и разработка нормативной документации на корни астрагала перепончатого Для характеристики сырья – корней астрагала перепончатого предложены следующие показатели качества: подлинность, доброкачественность и стабильность сырья в условиях естественного старения.

В качестве критериев подлинности корней астрагала перепончатого предложены макро- и микродиагностические признаки, качественные реакции определения флавоноидов, аминокислот, полисахаридов и сапонинов в извлечениях корней астрагала перепончатого, определение свободных аминокислот методом ТСХ в присутствии стандартов-свидетелей.

Качественные реакции. 5 г измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды очищенной и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильников в течение 30 минут.

Извлечение охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через бумажный складчатый фильтр «красная лента», упаривают до 5 мл (раствор А).

Для проведения качественных реакций:

- смешивают равные объемы раствора А и 0,1% спиртового раствора нингидрина и осторожно нагревают. При охлаждении появляется краснофиолетовое окрашивание (аминокислоты);

- к раствору А приливают 95% спирт в соотношении 1:5, появляется белый хлопьевидный осадок (полисахариды);

- к 2 мл раствора А приливают 1 мл 10% раствора натрия нитрита и 1 каплю серной кислоты концентрированной, появляется кроваво-красное окрашивание (тритерпеновые сапонины);

- 1 мл раствора Б переносят в пробирку вместимостью 10 мл, вносят 50 мг порошка металлического магния и 3 мл хлористоводородной кислоты концентрированной. После прекращения реакции раствор окрашивается в красно – оранжевое окрашивание (флавоноиды).

Хроматография. На линию старта хроматографической пластинки ПТСХПА-УФ «Sorbfil» размером 15х15 см или 10х15 см наносят дробно в первую точку 0,05 мл раствора А. Рядом на расстоянии 3 см от первой точки во вторую точку наносят 0,005 мл 0,02% раствора РСО аспарагина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе и помещают в камеру со смесью растворителей пропанол - вода (70:30) и хроматографируют восходящим способом. После прохождения фронтом растворителей 10 см, пластинку вынимают из камеры и высушивают на воздухе. Затем хроматограмму опрыскивают 0,2% спиртовым раствором нингидрина и нагревают в сушильном шкафу при температуре 100С в течение 10 - 15 минут. На уровне зоны-свидетеля должна обнаруживаться доминирующая фиолетовая зона с Rf ~ 0,28. Допускается наличие других фиолетовых, розово-оранжевых зон (аминокислот).

В качестве критериев доброкачественности корней астрагала перепончатого разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин и установлены числовые показатели по результатам товароведческого анализа (глава 3, п. 3.3.).

Разработка методики количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин в корнях астрагала перепончатого Проведенные исследования с помощью ионообменной хроматографии (п.

а также дальнейшие измерения с использованием метода 3.4.4.), спектрофотометрии показали большое содержание аминокислот в корнях астрагала перепончатого. Поэтому количественную стандартизацию корней растения проводили по данному показателю.

Разработана методика количественного определения суммы свободных аминокислот, основанная на нингидриновой реакции с образованием комплекса голубого цвета с максимумом поглощения при длине волны 569 ± 2 нм [46].

Количественное определение суммы свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого рассчитано по стандартному образцу аcпарагина, оптическую плотность которого измеряли параллельно с раствором исследуемого образца. Выбор этой аминокислоты в качестве стандартного образца основан на спектрах поглощения комплексов аминокислот корней астрагала перепончатого и аспарагина с нингидрином (рисунок 16) и данных ионообменной хроматографии (п. 3.4.4.).

0,6

–  –  –

Рисунок 16 - Спектры поглощения комплексов 10% спиртового извлечения корней астрагала перепончатого и раствора РСО аспарагина с 0,4% водным раствором нингидрина При разработке методики проведен подбор оптимальных условий извлечения суммы свободных аминокислот из корней астрагала перепончатого (таблица 12).

Таблица 12 – Содержание суммы свободных аминокислот в извлечениях корней астрагала перепончатого в зависимости от условий экстракции

–  –  –

Для интенсификации процесса экстракции и полноты выхода свободных аминокислот из корней астрагала перепончатого изучено влияние кратности и времени экстракции (таблица 13).

Таблица 13 – Содержание суммы свободных аминокислот в извлечениях корней астрагала перепончатого в зависимости от кратности и времени экстракции

–  –  –

Установлено, что максимальная оптическая плотность фотометрической реакции достигается при использовании 1 мл извлечения корней астрагала перепончатого с 1 мл 0,4% водного раствора нингидрина, время нагревания на кипящей водяной бане полученной реакционной смеси – 30 минут, устойчивое окрашивание после охлаждения наступает через 20 минут и сохраняется в течение 25 минут.

Немаловажное значение имеет соблюдение следующих условий - рН реакционной смеси и наличие восстановительной среды. Интенсивность развивающейся окраски зависит от кислотности среды, и при рН 5 - 6 для всех аминокислот становится максимальной [46]. Окислители, в частности кислород воздуха, снижают интенсивность окраски, особенно при малой концентрации аминокислот. Присутствие восстановителей, окисляющихся в первую очередь, снимает мешающий эффект кислорода воздуха. Первое условие достигается добавлением к реагенту буферного раствора, второе - добавлением какого-либо восстановителя (мы использовали 0,05% водный раствор аскорбиновой кислоты).

Для выбора типа буферного раствора изучена зависимость окраски нингидриновой реакции от рН буферного раствора в области рН 5,0 - 6,0. Для стабилизации нингидринового комплекса в реакционную смесь добавляется 2 мл ацетатного буфера рН = 4,5 (таблица 15) и 2 мл 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты.

Таблица 15 - Влияние рН среды на выраженность протекания реакции комплексообразования

–  –  –

Методика. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм.

Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 10% спирта, нагревают на водяной бане при температуре 40°С с обратным холодильником в течение 1 часа.

После охлаждения извлечение фильтруют через складчатый бумажный фильтр «красная лента» в мерную колбу вместимостью 200 мл, следя за тем, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Экстракцию повторяют со 100 мл 10% спирта в течение 30 минут. Полученное извлечение также фильтруют в мерную колбу, доводят объем раствора в колбе 10% спиртом до метки, перемешивают (раствор А). В пробирку вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют к нему 2 мл ацетатного буфера 4,5, 2 мл 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты, 1 мл 0,4% водного раствора нингидрина и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. После охлаждения раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и через 1 ч после начала реакции определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 569±2 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Параллельно проводят реакцию свежеприготовленного раствора РСО аспарагина (1 мл) с 0,4% водным раствором нингидрина (1 мл) в присутствии ацетатного буфера 4,5 (2 мл), 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты (2 мл) и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 569±2 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D m0 1 200 100 100 D m0 200 X ;

D0 m 100 100 1 (100 W ) D0 m 100 W где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 – оптическая плотность раствора РСО аспарагина;

m – масса сырья, г;

m0 – масса РСО аспарагина, г;

W – влажность сырья, %.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого приведены в таблице 16.

Таблица 16 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин в корнях астрагала перепончатого

–  –  –

Относительная ошибка единичного определения не превышает 5%.

Установлена норма содержания суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин в корнях астрагала перепончатого – не менее 10,0% (Приложение 5).

Данные, полученные в результате проведения валидации методики количественного определения суммы свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого в пересчете на аспарагин, позволяют оценить метод положительно по параметрам: линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность (Приложение 4).

В нашей дальнейшей работе с помощью разработанной методики количественного определения свободных аминокислот изучены образцы сырья корней астрагала перепончатого, собраннные в различных местах произрастания (таблица 17).

Таблица 17 – Содержание свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого, собранных в различных местах произрастания

–  –  –

Полученные данные свидетельствуют о том, что содержание свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого, собранных в различных районах Республики Бурятия и Забайкальском крае, находится в пределах 10,48 – 12,92%.

Наибольшее содержание свободных аминокислот отмечено в Баргузинском и Заиграевском районах и в Забайкальском крае.

Динамика накопления свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого С целью установления оптимальных сроков заготовки растительного сырья исследована динамика накопления суммы свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого в зависимости от фазы вегетационного периода (таблица 18).



Pages:   || 2 | 3 |
Похожие работы:

«Физиология, биохимия, биофизика ISSN 0868-854 (Print) ISSN 2413-5984 (Online). Аlgologia. 2016, 26(3):237—247 http://dx.doi.org/10.15407/alg26.03.237 УДК 582.261.1:573.7:574.6 РЯБУШКО В.И., ЖЕЛЕЗНОВА С.Н., ГЕВОРГИЗ Р.Г., БОБКО Н.И., ЛЕЛЕКОВ А....»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФГБОУ ВПО “Уральский государственный лесотехнический университет” Кафедра химии Разработчики: доцент Серова Е.Ю., профессор Дрикер Б.Н. ЭКОЛОГИЯ Курс лекций, лабораторно-практических заняти...»

«HT-Line® Maintest-5i Результаты тестирования Тест: Большая Пятерка 2 (ипсати. HUMAN T E CHNOL OGIE S L ABORAT ORY Информация о тестировании Название теста: Большая Пятерка 2 (ипсативная) Дата тестирования: 03.07.2014 (Чт), 18:30:05 (+0400) Продолжительность: 00:04:23...»

«Известия Челябинского научного центра, вып. 3 (33), 2006 БИОЛОГИЯ УДК 599.35/.38+504.74.05+502.31:911.375+591.67 НОВАЯ СИНАНТРОПНАЯ ПОПУЛЯЦИЯ CROCIDURA SUAVEOLENS (PALLAS, 1811) НА УРАЛЕ И ЕЕ РОЛЬ В ПРИРОДНО–ОЧАГОВОЙ ИНФЕКЦИИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ Н.Ф. Черноусова, О.В. Тол...»

«АНТИПИНА Ольга Валерьевна СПОСОБНОСТЬ ЛИСТЬЕВ И КОРНЕЙ ТЕПЛОЛЮБИВЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА К ФОРМИРОВАНИЮ УСТОЙЧИВОСТИ К ГИПОТЕРМИИ 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в лаборатории зимостойкости Учреждения Россий...»

«Почвоведение и агрохимия № 2(51) 2013 INFLUENCE OF OMPOSITE MINERAL MACROAND MICROFERTILIZERS AND PESTS ON YIELD STRUCTURE OF VARIOUS WINTER WHEAT VARIETIES A.A. Zhagun’ Summary Impact of complex use of nitrogen fertilizers, copper and manganese microfertilizers, retardant and fungicides on structure formation of yield of tw...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Кубанский государственный аграрный университет Кафедра биотехнологии, биохимии и биофизики МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ для проведения семинарских занятий по курсу Методы исследования отходов промышленной пер...»

«1005459 ЭФФЕКТИВНЫЕ ЭРГОНОМИЧНЫЕ ЭКОЛОГИЧНЫЕ ЖИВОТНОВОДЧЕСКИЕ КОМПЛЕКСЫ НОВОГО ТЫСЯЧЕЛЕТИЯ WWW.YASNOGORFARMS.RU вешала PELLON © KRAI BURG У' SUEVIA CHHORMANN I ФЕРМЫ Уважаемые д а м ы и господа! ЯСНОГОРЬЯ Вас приветствует компания "Фермы Ясногорья"! Мы с удивлением замечаем, как стремительно меняется мир вок...»

«Бюллетень Никитского ботанического сада. 2006. Вып. 92 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРЯМОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ МИКРОПОБЕГОВ КОТОВНИКА И ИССОПА IN VITRO С ЦЕЛЬЮ ПОПОЛНЕНИЯ ГЕНОФОНДА И.В. МИТРОФАНОВА, кандидат биологических наук; В.Д. РАБОТЯГОВ, доктор биологических наук; Н.Н. ИВАНОВА Никитский ботан...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ СТУДЕНЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ 2013 ФГБОУ ВПО "ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Факультет Агробизнеса и экологии Реферат ИНФОРМАЦИОННОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПО ЗАЩИТЕ КУКУРУЗЫ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Научное направление: Сельскохозяйственные науки Название предполага...»

«***** ИЗВЕСТИЯ ***** № 3 (35), 2014 Н И Ж Н Е В О Л ЖС К О Г О А Г Р О У Н И В Е Р С И Т Е Т С КО Г О К ОМ П Л Е К С А АГРОНОМИЯ И ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО УДК:633.2.033.2:633.26/.29.039(470.45) БИОЛОГО-АГРОТЕХНИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ ИЗЕНЯ (ПРУТНЯК) (KOCHIA PROSTRATA) В УСЛОВИЯХ ПОВОЛЖЬЯ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ...»

«Рассмотрена на заседании МО Принята на педсовете "Утверждаю" Протокол № 1 от 26.08.2011г. Протокол № 1 от 29.08.2011г. Приказ №115 от 1.09.2011г. Руководитель МО учителей Директор школы:_ естественногеографического цикла _ /Халь...»

«УДК 581.9 ЛАНДШАФТЫ И БИОРАЗНООБРАЗИЕ УРОЧИЩА КРЕЙДЯНКА – ПЕРСПЕКТИВНОГО ОБЪЕКТА ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ В СИСТЕМУ СТЕПНЫХ ПАМЯТНИКОВ ПРИРОДЫ КУРСКОЙ ОБЛАСТИ © 2012 А. В. Полуянов1, Г. Н. Дьяченко2, Н. С. Малышева3, В. И Миронов4, Н. В. Чертков5 канд. биол. наук, доцент каф. биологии растений и животных e-mail: Alex...»

«Гаева Дара Владимировна ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОПТИМИЗАЦИИ ПЧЕЛОВОДСТВА В СИСТЕМЕ АГРАРНОГО ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ КАЛИНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность 25.00.36 – геоэкология (науки о Земле) АВТОРЕ...»

«Всероссийская молодёжная научно­практическая конференция "Фундаментальные основы современных аграрных технологий и техники" ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПОВЫШЕНИЯ СЕМЕННОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО Ю.О. Пономарев, аспирант кафедры агрономии и э...»

«Образовательное учреждение высшего образования Тверской институт экологии и права Кафедра Финансов и менеджмента РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ (МОДУЛЯ) СТАТИСТИКА 080100.62 "Экономика" Направление подготовки Профиль подготовки "Финансы и кредит" Квалификация (степени) выпускника Бакалавр Тверь, 2014...»

«Белорусский государственный университет УТВЕРЖДЕНО Проректор по учебной работе БГУ ОСНОВЫ ПРОМЫШЛЕННОЙ АСЕПТИКИ Учебная программа для специальности 1-31 05 01 Химия (по направлениям) Направление специальности: 1-31 05 01-03 Химия (фармацевтическая деятельность) Специализация 1-31 05 01-03-02 "Технология лекарственных средст...»

«HT-Line® Maintest-5i Результаты тестирования Тест: Бизнес-профиль-6 HUMAN T E CHNOL OGIE S L ABORAT ORY Информация о тестировании Название теста: Бизнес-профиль-6 Дата тестирования: 03.07.2014 (Чт), 18:02:08 (+0400) Продолжительность: 00:49:31 Номер протокола: 00562578 Информация о респонденте Имя респондента: Петров...»

«МУЛЬТИМЕДИЙНЫЕ ИНТЕРАКТИВНЫЕ РЕСУРСЫ В ОБРАЗОВАТЕЛЬНОМ ПРОЦЕССЕ: РЕАЛИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ* Феликс Освальдович Каспаринский, руководитель Лаборатории мультимедийных технологий Биологического факультета МГУ имени М....»

«УДК 662.636:631.95 А. В. Сорока1, Н. Н. Костюченко1, Е. А. Брыль1, И. Н. Кузнецов2 Полесский аграрно-экологический институт НАН Беларуси, г. Брест, Республика Беларусь Белорусский государственный технологический университет, г. Минск, Респу...»

«1. Цели и задачи дисциплины Цель: Вооружить студентов теоретическими знаниями биологических особенностей технических культур, а также практическими навыками при выращивании этих...»

«ЮНЕСКО: ОБРАЗОВАНИЕ, НАУКА, КУЛЬТУРА УДК 17:57 ЭКОЛОГО-ЭТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГЛОБАЛЬНОГО ИЗМЕНЕНИЯ КЛИМАТА В КОНТЕКСТЕ СОЦИАЛЬНЫХ ИНИЦИАТИВ ЮНЕСКО ENVIRONMENTAL AND ETHICAL ASPECTS OF GLOBAL CLIMATE CHANGE IN THE CONTEXT OF UNESCO SOCIAL INITIATIVES МИШАТКИНА Т.В., канд. ф...»

«Chronolab Systems S.L., под контролем Chrono РЕАГЕНТЫ ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ in vitro ИНСТРУКЦИИ по применению реагентов SANTE тШ ЛИНЕЙКА АВТОМАТИЧЕСКИХ БИОХИМИЧЕСКИХ АНАЛИЗАТОРО...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ГЕОДЕЗИИ И КАРТОГРАФИИ (МИИГАиК) СБОРНИК ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ И ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ ПО УЧЕБНОМУ КУРСУ "БЕЗОПАСНОСТЬ Ж...»

«Бюллетень Никитского ботанического сада. 2009. Вып. 98 9 ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO ARTEMISIA DRACUNCULUS L. А.Г. ИНЮТКИНА; Н.А. ЕГОРОВА, кандидат биологических наук Институт эфиромасличных и лекарственных растений УААН, г. Симферополь Введение Различные виды рода Artemisia L., относящиеся к семей...»

«БАСОВ Александр Александрович УРОЖАЙНЫЕ СВОЙСТВА КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ИХ ЕЖЕГОДНОЙ ПОВТОРНОЙ СОРТИРОВКЕ В РАСТВОРЕ КАРБАМИДА И ОБРАБОТКЕ БИОПРЕПАРАТАМИ БИОПЛАНТ КОМПЛЕКС И НИКФАН Специальность 06.01.09 – растениеводство АВТОРЕФЕРАТ диссер...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ СЕЛЬСКОГО ПОСЕЛЕНИЯ ВЕСЕЛЁВСКОЕ НАРО-ФОМИНСКОГО МУНИЦИПАЛЬНОГО РАЙОНА МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ РАСПОРЯЖЕНИЕ от _13.01.2015_№ 2-р д. Веселево Об утверждении формы справки о доходах, расходах, об имуществе и обязательствах имущественного характера В соответствии с Феде...»

«www.ctege.info Задания С4 по биологии 1. Кета вымётывает во время нереста около миллиона икринок, и только незначительная часть мальков достигает зрелого возраста. Назовите несколько причин такого "выжива...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ПОСТАНОВЛЕНИЕ АДМИНИСТРАЦИИ ПЕТУШИНСКОГО СЕЛЬСКОГО ПОСЕЛЕНИЯ Петушинского района Владимирской области от 03.12.2014 д. Старые Петушки № 716 Об утверждении формы справки о доходах, расхо...»

«Шлыков Сергей Николаевич ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОДУКТОВ МЯСНОГО СКОТОВОДСТВА НА ОСНОВЕ ПРОГРЕССИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ СЕЛЕКЦИИ И КОРМЛЕНИЯ ЖИВОТНЫХ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание уче...»









 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.