WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

Pages:     | 1 || 3 |

«РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Определение содержания свободных аминокислот проводили по разработанной нами методике (с. 79). Образцы сырья были собраны в маесентябре в Тарбагатайском районе Республики Бурятия (с. Вахмистрово).

Таблица 18 – Содержание свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого, собранных в различные фазы вегетационного периода

–  –  –

Проведенные исследования показали, что наибольшее содержание суммы свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого наблюдается в фазу плодоношения поэтому оптимальными сроками сбора корней астрагала перепончатого являются август-сентябрь.

Установление срока годности корней астрагала перепончатого При хранении в естественных условиях (в сухом, защищенном от света месте, при комнатной температуре) показатели качества определялись через каждые 6 месяцев. На основании полученных данных, срок годности корней астрагала перепончатого установлен в 2 года, что подтверждено результатами изучения стабильности средства в течение 2,5 лет (Приложение 5).

–  –  –

механических волокон с характерными утолщенными стенками и продольными трещинами, сетчатых сосудов древесины, каменистых клеток изодиаметрической или вытянутой формы с утолщенными, бороздчатыми стенками и простых крахмальных зерен.

2. Качественными реакциями, а также методами БХ, ТСХ и ВЭЖХ подтверждено наличие в корнях астрагала перепончатого аминокислот, флавоноидов (катехин, эпигаллокатехингаллат, эпикатехин, дигидрокверцетин, лютеолин-7-гликозид, рутин, кемпферол, нарингенин), фенолкарбоновых (галловая), оксикоричных (о-кумаровая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, неохлорогеновая, феруловая, изоферуловая), коричной и аскорбиновой кислот, дубильных веществ (таннин), кумаринов (кумарин, о-метоксикумарин), тритерпеновых сапонинов, углеводов, белковых веществ и алкалоидов.

3. Состав жирных кислот корней астрагала перепончатого представлен 11 соединениями, в наибольшем количестве присутствуют ненасыщенные – линолевая (37,75%), -линоленовая (14,05%), олеиновая (6,88%) и насыщенная – пальмитиновая (25,23%) кислоты.

4. В корнях астрагала перепончатого обнаружены 17 свободных и 19 связанных аминокислот, среди них 9 незаменимых аминокислот (треонин, метионин, изолейцин, лейцин, лизин, гистидин, аргинин, валин, фенилаланин);

суммарное содержание свободных аминокислот в сырье составляет 7,09 мг/г, в наибольшем количестве присутствуют аспарагин – 31,60%, аргинин – 27,11%, глютамин – 21,27% и глутаминовая кислота – 10,14% (от общего количества аминокислот); суммарное содержание связанных аминокислот – 47,94 мг/г, среди которых преобладают пролин – 15,75%, глутаминовая кислота – 13,65%, аспарагиновая кислота – 12,98%, гистидин – 10,68% и аргинин – 10,22% (от общего количества аминокислот).

5. Установлено наличие 28 макро- и микроэлементов в корнях астрагала перепончатого методом эмиссионного спектрального анализа; макроэлементы представлены K – 0,51%, Ca – 0, 25%, Р – 0,15%, Mg – 0,11% и Na – 0,005%, среди микроэлементов преобладают Fe – 168,90 мг/кг, Mn – 14,70 мг/кг, B – 13,80 мг/кг;

содержание азота общего 2,30%.

6. Углеводный комплекс корней астрагала перепончатого представлен фракциями: свободные углеводы (СУ) – 9,23%, водорастворимые полисахариды (ВРПС) – 8,32%, пектиновые вещества (ПВ) – 7,02%, гемицеллюлозы А (Гц А) – 13,17%, гемицеллюлозы Б (Гц Б) – 2,12%, компонентный состав которых представлен: СУ – мальтотриоза, ксилоза, манноза; ВРПС – глюкоза, мальтоза, полимер; ПВ – манноза, глюкоза; Гц А – мальтоза, глюкоза, ксилоза, полимер; Гц Б – мальтоза, глюкоза, ксилоза, манноза, галактоза, полимер.

7. Установлено количественное содержание БАВ в корнях астрагала перепончатого: органических кислот 1,96±0,03%, дубильных веществ 0,44±0,02%, тритерпеновых сапонинов 1,51±0,04%.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО

СРЕДСТВА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО

4.1. Обоснование состава растительного сбора Разработка состава сбора нейропротективного проводилась на основе изучения сведений об этиологии и патогенезе цереброваскулярных заболеваний, химическом составе биологически активных веществ растений, опыте их использования в официальной, традиционной и народной медицинах.

В сбор нейропротективный были включены растения антиоксидантного, анксиолитического, гипотензивного, успокаивающего, противовоспалительного и нейромодулирующего действия, отличающиеся по химическому составу и имеющие особенности фармакологического действия, что позволяет достичь в полной мере комплексного нейропротективного действия.

Одними из основных причин инсульта являются гипертония, гиперхолестеринемия, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания и сахарный диабет, что также учитывалось при выборе лекарственных растений.

Доля каждого вида сырья и рациональность их сочетания определялись с учетом механизма развития нарушений мозгового кровообращения, официнальности и состояния сырьевой базы. Лекарственные растения, включенные в растительную композицию, содержат флавоноиды, сапонины, кумарины, дубильные вещества, органические кислоты, витамины, макро- и микроэлементы, обеспечивающие синергетическое антиоксидантное действие. Антиоксидантное действие осуществляется путем защиты липидов и мембранных белков клеток от перекисного окисления, укрепления стенок капилляров и сосудов, выведения излишек холестерина из состава крови, усиления и потенциирования действия сопутствующих компонентов. Наличие в растениях заменимых и незаменимых аминокислот способствует восстановлению структуры клеток, усилению регенеративных процессов, уменьшению дистрофических проявлений.

Использование комплекса биологически активных веществ в таком сочетании в сборе необходимо для обеспечения адекватной фармакологической коррекции нарушений кровообращения головного мозга.

–  –  –

На основании фитохимического изучения сборов выбран вариант сбора № 1, т.к. он отличался большим содержанием экстрактивных и действующих веществ, подтверждена его нейропротективная активность (Приложение 2).

Таким образом, на основании результатов фитохимического анализа и фармакологических испытаний объектом дальнейшего исследования выбран сбор из лекарственного растительного сырья следующего состава: корни астрагала перепончатого - 40 ч; корни шлемника байкальского - 35 ч; корневища и корни вздутоплодника сибирского - 25 ч.

4.3. Разработка технологии получения сбора Технологическая схема получения сбора разработана в соответствии с требованиями Стандарта отрасли ОСТ 42-510-98 и «Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP)», утвержденным Министерством здравоохранения Российской Федерации 25 февраля 1998 г. (ред.

от 25.11.2001) и отработана на лабораторном оборудовании. Технологическая схема получения сбора представлена на рисунке 17.

Основные стадии технологического процесса:

BP. 1. Вспомогательные работы.

ТП. 1. Измельчение растительного сырья.

ТП. 2. Получение готового продукта (сбора).

УМО. 1. Фасовка, маркировка и упаковка сбора.

Изложение технологического процесса.

ТП. 1. 1. Подготовка растительного сырья Растительное сырье, соответствующее требованиям нормативной документации (НД), предварительно просматривали и просеивали, чтобы исключить механические включения. Затем сырье поступает на измельчение.

ТП. 1. 2. Измельчение растительного сырья Корни астрагала перепончатого, корни шлемника байкальского, корневища и корни вздутоплодника сибирского измельчали на универсальной мельнице до размера частиц 2 мм. Установленное соотношение между размерами частиц сырья в сборе обеспечивают более равномерное смешивание. Перед началом измельчения проверяли мельницу и отсутствие остатков другого сырья после измельчения. Сырье засыпали и выгружали вручную.

ТП. 1. 3. Просеивание измельченного сырья.

Сырье, необходимое для приготовления сбора, предварительно просеивали, чтобы исключить механические примеси и иметь сырье с однородной величиной частиц, обеспечивающей равномерное смешивание.

Приступая к работе проверяли чистоту сит, чистоту и целостность сеток.

Просев вели вручную через сито с закрепленным донышком. В случае необходимости просеиваемый материал протирали рукой (в перчатке). При просеве необходимо работать осторожно, избегая пылеобразования. Работать в маске «Лепесток».

Корни астрагала перепончатого просеивали в количестве 408 г, получали 400 г; корни шлемника байкальского – 357,6 г – 350 г; корневища и корни вздутоплодника сибирского – 252,5 г – 250 г. Полученное растительное сырье передавали на следующую стадию.

Потери сырья при измельчении составляли 0,018 кг или 1,78 %.

Выход на стадии – 98,22 % Выход от начала технологического процесса – 98,22 %.

ТП. 2. Получение готового продукта - сбора ТП. 2. 1. Смешивание компонентов сбора Просеянные компоненты сбора тщательно смешивали в смесителе до получения однородной массы. Оценку внешнего вида сбора выполняли на основании осмотра невооруженным глазом. Отбирали среднюю пробу для анализа.

УМО 1.

Фасовка и упаковка сбора Процесс фасовки осуществлялся вручную и состоял из следующих операций:

1. Штамповка серий на бандеролях.

2. Открытие торцевых клапанов пачки.

3. Формирование пакетов.

4. Укладка пакетов в пачки.

5. Взвешивание сырья.

6. Засыпка сырья в пачки при помощи совка.

7. Закрытие пакетов.

8. Закрытие торцевых клапанов пачек.

Пачки со сбором поступали на стол укладки и вручную укладывали в:

- ящики фанерные по ГОСТ 5959 – 80, выстланные бумагой мешочной по ГОСТ 2228 – 81, или под пергаментом по ГОСТ 1760 – 86;

- ящики из гофрированного картона по ГОСТ 9142 – 90, выстланные бумагой мешочной по ГОСТ 2228 – 81, или под пергаментом по ГОСТ 1760 – 86. Ящики фанерные должны быть закрыты крышкой и забиты гвоздями, ящики из гофрированного картона должны быть оклеены лентой из бумаги марки М – 70 по ГОСТ 2228 – 81, или лентой клеевой на бумажной основе по ГОСТ 18251 – 87.

Потери сырья при фасовке и упаковке сбора составили 0,017 кг или 1,70%.

Выход на стадии – 98,30%.

Выход от начала технологического процесса – 96,52%.

Рисунок 17 - Технологическая схема производства сбора нейропротективного

4.4. Товароведческий анализ сбора нейропротективного При составлении сбора использовалось растительное сырье, отвечающее требованиям НД (корни астрагала перепончатого – проект ФС – приложение 3, корни шлемника байкальского - ФС 42-453-91, корневища и корни вздутоплодника сибирского - ФС 42-2667-89).

Для установления числовых показателей сбора нейропротективного проведен товароведческий анализ 5 серий сбора, которые оценивали по

–  –  –

2 021211 5,29 2,31 7,08 1,12 1,78 2,10 4,25 26,12 3 031211 8,33 4,38 7,90 1,25 1,85 2,50 4,37 27,39 4 041211 7,55 4,02 8,03 1,49 1,82 2,60 4,48 30,05 Содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой, в опытных сериях сбора составило от 26,12% до 30,05%; золы общей от 5,29% до 8,33%; золы не растворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – от 2,31% до 4,38%;

влажность – от 7,08% до 7,80%; степень измельчения: частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм – от 2,10% до 2,80%; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм – от 4,25% до 4,90%; органической примеси – от 1,12% до 1,49%, минеральной примеси – 1,82% до 1,96%.

На основании полученных данных определены числовые показатели для сбора нейропротективного: экстрактивных веществ не менее 26,0%; золы общей не более 10,0%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, не более 5,0%; влажность не более 10,0%; частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, не более 3,0%; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм, не более 5,0%;

органической примеси не более 1,5%, минеральной примеси не более 2,0%.

4.5. Изучение внешних признаков сбора Установление подлинности сбора нейропротективного проводили согласно статье «Сборы» (ГФ ХI, вып.1, с. 266). Наиболее сохраняемые и воспроизводимые анатомо-морфологические признаки компонентов сбора имеют основополагающее диагностическое значение для его идентификации.

Компоненты, входящие в состав сбора, были измельчены до размера частиц 2,0 мм и просеяны сквозь сито с размером отверстий 0,18 мм для удаления пыли.

Изучение внешних признаков проводили в 2 этапа: сначала осматривали невооруженным глазом, отмечая общую структуру и цвет растительной смеси, затем сбор изучали под лупой и стереомикроскопом. Вкус водного извлечения определяли, анализируя отвар сбора.

Сбор нейропротективный представляет собой порошок, состоящий из неоднородных частиц от желтого до бежевого цвета с темно-коричневыми включениями. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения сладковато-горький.

При просмотре сбора под лупой (х10) обнаружены фрагменты подземных органов:

– кусочки корней светло-бежевого цвета с коричневыми частицами коры (корни астрагала перепончатого);

- кусочки корней от лимонно-желтого до коричневого цвета (корни шлемника байкальского);

- кусочки корневищ и корней различной формы желтовато – белого цвета с коричневыми частицами коры (корневища и корни вздутоплодника сибирского);

Данные внешних признаков сбора рекомендованы как характерные диагностические признаки и включены в нормативные документы на сбор нейропротективный.

4.6. Изучение микроскопических признаков сбора Предварительно изучались анатомо-диагностические признаки каждого компонента сбора.

Данные по анатомическому строению корней астрагала перепончатого (поперечный срез и порошок) представлены в главе 3, п. 3.2.

При исследовании микропрепаратов поперечного среза корней шлемника байкальского (рисунок 18) под микроскопом обнаружены: группы склереид в коровой части корня, расположенные концентрическими прерывистыми поясами.

Сосуды и трахеиды древесины расположены тангенциально вытянутыми группами, сердцевидные лучи широкие, многорядные. Клетки паренхимы и сердцевинных лучей заполнены крахмальными зернами.

Для порошка корней шлемника байкальского (рисунок 19) характерно наличие участков паренхимы, состоящей из округлых или округлопрямоугольных клеток; крахмальные зерна, склереиды, расположенные группами и обрывки сосудов.

При рассмотрении поперечного среза корневищ и корней вздутоплодника сибирского (рисунок 20) видны: узкий слой темно-коричневой пробки, широкая кора, с радиально вытянутыми разрывами вдоль сердцевинных лучей, четкая линия камбия и древесина. Диагностическое значение имеют многочисленные секреторные каналы, расположенные концентрическими кругами. Секреторные каналы корней 1 - 2 мм, под пробкой в сердцевине – до 300 - 600 мкм. В анатомическом строении корневищ и корней растения – стеблекорня, гипокотиля и корня – наиболее характерным является строение секреторного аппарата, представленного густой сетью каналов, разнообразных по форме и диаметру, как правило, цилиндрической формы. В самом наружном слое коры корня и гипокотиля, под пробкой, из ответвлений секреторных каналов образуются гигантские резервуары округлой или овальной формы до 2 - 4 мм в диаметре.

Порошок корневищ и корней вздутоплодника сибирского (рисунок 21) представляет собой смесь участков коры, волокон оранжевато-желтого цвета и скопления узких сосудов, расположенных очень плотно друг к другу.

А В Б

–  –  –

Е Ж З Рисунок 21 - Микроскопическое строение порошка корневищ и корней вздутоплодника сибирского (Е, Ж, З – увеличение 10х10, 2 – клетки паренхимы, 8 – волокна либриформа, 9 – сосуды ксилемы, 10 – клетки пробки) Далее порошок сбора нейропротективного исследовали на совместное присутствие компонентов в микропрепарате с целью выявления частоты встречаемости диагностически значимых признаков (рисунок 22) и расчета индексов участия компонентов сбора (таблица 23), используя методику количественного определения компонентов сбора [120] (с. 452 в приведенном источнике литературы). Каждое растение имеет свой набор анатомодиагностических признаков (как минимум 6 - 7), но для данной методики необходимо выбрать диагностически значимые признаки – это явные, резко отличающие растение от других, имеющие высокий процент встречаемости, признаки. Так, для корней астрагала перепончатого диагностически значимыми признаками выбраны бесцветные механические волокна и сетчатые сосуды древесины. Механические волокна наблюдались на микропрепаратах корней астрагала перепончатого (бесцветные и оранжевато-желтые волокна) и А Б

–  –  –

корневищ и корней вздутоплодника сибирского (оранжевато-желтые волокна), однако только у астрагала перепончатого наблюдались бесцветные волокна и они имели высокую частоту встречаемости в растении. Сетчатые сосуды также являются отличительной особенностью корней астрагала перепончатого и имеют высокий процент встречаемости в растении. Таким же образом выбраны диагностически значимые признаки для остальных растений (по 2 признака от каждого растения): для корней шлемника байкальского – клетки паренхимы и склереиды, для корневищ и корней вздутоплодника сибирского – клетки паренхимы и группы узких сосудов, расположенных, как правило, очень плотно друг к другу.

Таблица 23 - Индексы участия компонентов сбора нейропротективного

–  –  –

Представленные результаты свидетельствуют, что средняя ошибка определения составляет 4,65 %.

Таким образом, при микроскопическом исследовании 10 серий сбора на совместное присутствие его компонентов установлено, что в каждом микропрепарате обнаруживаются бесцветные механические волокна и сетчатые сосуды корней астрагала перепончатого, клетки паренхимы (округлой формы, окрашенные в желтый цвет) и склереиды корней шлемника байкальского, клетки паренхимы (извилистой формы, бесцветные) и группы сосудов (расположенных очень плотно друг к другу) корневищ и корней вздутоплодника сибирского.

Определены индексы участия для компонентов сбора: 42,30±2,10 – для корней астрагала перепончатого, 34,67±1,58 – для корней шлемника байкальского, 23,03±1,02 – для корневищ и корней вздутоплодника сибирского. Полученные данные свидетельствуют о том, что найденные индексы участия компонентов соответствуют их содержанию в сборе, что может служить дополнительным критерием доброкачественности сбора нейропротективного.

Проведенные исследования по изучению диагностических признаков сбора были использованы при разработке проекта ФСП на сбор нейропротективный.

4.7. Фитохимическое изучение сбора нейропротективного 4.7.1. Обнаружение основных групп биологически активных веществ с помощью качественных реакций Для предварительной химической оценки был проведен анализ извлечений сбора нейропротективного на наличие основных групп биологически активных соединений. В результате качественного анализа, проведенного по приведенным выше методикам (глава 3, п. 3.4.1), в сборе нейропротективном обнаружены аминокислоты, флавоноиды, дубильные вещества, кумарины, тритерпеновые сапонины, углеводный комплекс, белковые вещества и алкалоиды.

4.7.2. Обнаружение веществ методом БХ Проведено изучение 70% спиртового извлечения сбора методом двумерной хроматографии на бумаге марки Filtrak FN-8 и FN-16, в системах растворителей 1 и 2. Хроматограммы просматривали в УФ-свете, проявляли 5% раствором алюминия хлорида (для идентификации флавоноидов) и парами аммиака (для фенолкарбоновых кислот).

На хроматограммах выявлены 12 зон фенольных соединений, которые в УФ-свете обладают собственной флуоресценцией желтого, фиолетового и голубого цвета. После обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида флуоресценция усилилась, и зоны приобрели желтый, желто-зеленый, коричневый и фиолетовый цвет. Из обнаруженных 12 зон 8 отнесено к веществам флавоноидного характера (идентифицировано 4 веществ), 7 – к фенолкарбоновым кислотам. Результаты хроматографического анализа фенольных соединений сбора методом двумерной бумажной хроматографии представлены на рисунке 23 и в таблице 26.

Рисунок 23 - Схема двумерной хроматограммы 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного после обработки раствором AlCl3 (в УФ-свете) 1 – рутин, 2 – кверцетин, 3 – гиперозид, 4 – лютеолин, 5 – мирицетин, 6 – лютеолин-7гликозид, 7 – 70% спиртовое извлечение сбора нейропротективного Таблица 26 - Результаты хроматографического анализа фенольных соединений 70% спиртовых извлечений сбора нейропротективного методом двумерной БХ

–  –  –

Продолжение таблицы 26 - Результаты хроматографического анализа фенольных соединений 70% спиртовых извлечений сбора нейропротективного методом двумерной БХ

–  –  –

Таким образом, при хроматографировании 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного со стандартными образцами установлено присутствие в анализируемом образце кверцетина (Rf1=0,05, Rf2=0,78), лютеолина (Rf1=0,07, Rf2=0,84), лютеолин-7-гликозида (Rf1=0,11, Rf2=0,47), рутина (Rf1=0,56, Rf2=0,64).

3.1.3.3. Идентификация соединений методом ТСХ

Качественное определение байкалина проводили в системе 8 на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil». 0,05 мл спиртового извлечения сбора 70% нейропротективного (1:10) наносили микропипеткой на линию старта пластинки и хроматографировали в соответствующей системе параллельно с достоверным образцом байкалина. Хроматограммы высушивали на воздухе, обрабатывали 10% раствором серной кислоты и наблюдали оранжевую зону на белом фоне пластинки на уровне зоны РСО байкалина Rf ~ 0,19 (рисунок 24).

Рисунок 24 - Схема хроматограммы 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного (1) и 70% спиртового раствора байкалина (2) в системе хлороформ – метанол (6:4) после обработки 10% раствором H2SO4 Качественное определение кумаринов Хроматографирование проводили на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» в системах растворителей 5, 6, 7. По 0,1 мл хлороформного извлечения сбора нейропротективного (1:5) и 0,05 мл спиртовых растворов стандартов наносили микропипеткой на линию старта хроматографической пластинки. Пластинку с пробами высушивали на воздухе в течение 15 минут и помещали в предварительно насыщенную камеру. Когда фронт растворителя проходил до 10 см, ее вынимали, сушили на воздухе до полного удаления системы и просматривали окраску пятен в УФ-свете, затем пластинку обрабатывали последовательно 0,5% спиртовым раствором и диазореактивом, NaOH высушивали, прогревали в сушильном шкафу при 110°С в течение 5 минут и наблюдали изменение окраски зон адсорбции.

При использовании системы 5 происходило лучшее разделение веществ. В системе же 6 разделение было самым худшим, зоны адсорбции находились практически на одной линии, и возникали трудности при определении Rf веществ.

В системе 5 было обнаружено 6 зон адсорбции (рисунок 25):

Рисунок 25 - Схема хроматограммы хлороформного извлечения сбора нейропротективного (1) и спиртовых растворов стандартов (2 - фловерин - сумма дигидросамидина и виснадина, 3 пеуцинидин, 4 - умбеллиферон, 5 - скополетин) в системе гексан – бензол – метанол (5:4:1) в УФ-свете

1) Rf (1) = 0,14 (Rf (1) соответствует Rf скополетина (7), голубая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH;

вишневая – при последующей обработке диазореактивом);

2) Rf (2) = 0,25 (Rf (2) соответствует Rf дигидросамидина (8); фиолетовая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором оранжевая – при последующей обработке NaOH;

диазореактивом);

3) Rf (3) = 0,34 (Rf (3) соответствует Rf умбеллиферона (9); голубая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; светло-оранжевая – при последующей обработке диазореактивом);

4) Rf (4) = 0,57 (Rf (4) соответствует Rf пеуцинидина (10); фиолетовая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; оранжевая – при последующей обработке диазореактивом);

5) Rf (5) = 0,68 (Rf (5) соответствует с Rf виснадина (11); фиолетовая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; оранжевая – при последующей обработке диазореактивом);

6) Rf (6) = 0,76 (светло-зеленая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором оранжевая – при NaOH;

последующей обработке диазореактивом).

Качественное определение аскорбиновой кислоты проводили в водном извлечении сбора нейропротективного в системе растворителей 3 на пластинах «Silufol UV254».

На линию старта пластины микропипеткой наносили 0,5 мл водного извлечения сбора (1:10) и рядом 0,003 мл РСО аскорбиновой кислоты. Пластинку с нанесенными пробами помещали в камеру со смесью растворителей и хроматографировали восходящим способом. Когда фронт растворителей проходил 13 см, пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе в течение 5 минут и обрабатывали 0,04 % раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.

При просмотре хроматограммы наблюдали белую зону на розовом фоне пластинки на уровне зоны РСО кислоты аскорбиновой Rf ~ 0,90 (рисунок 26).

А Б Рисунок 26 - Схемы хроматограмм водного извлечения сбора нейропротективного (1) и раствора аскорбиновой кислоты (2) в системах этилацетат - ледяная уксусная кислота (80:20) (А) и этанол-уксусная кислота-вода (90:9:1) (Б) Также водное извлечение исследовали на содержание аскорбиновой кислоты в системе растворителей 4 на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» в темной камере. При достижении фронта растворителя 15 см, пластину вынимали, высушивали при комнатной температуре и обрабатывали 10% раствором фосфорно-молибденовой кислоты в 95% спирте. При просмотре хроматограммы наблюдали синюю зону на желтом фоне пластинки на уровне зоны РСО кислоты аскорбиновой Rf ~ 0,75 (рисунок 26).

4.7.4. Идентификация фенольных соединений методом ВЭЖХ На основании данных литературы и проведенных качественных реакций установлено, что в изучаемом сборе содержатся вещества фенольной природы.

Проведен анализ водно-спиртового извлечения сбора методом ВЭЖХ.

Методика приготовления 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм.

Около 3 г (точная навеска) измельченного сбора помещали в колбу вместимостью 200 мл, прибавляли 60 мл 70% спирта, присоединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили 70% спиртом до метки (исследуемый раствор).

По 50 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали по выше приведенной методике (глава 2, п.

2.2, с. 47).

Результаты проведенных исследований приведены в таблице 27 и на рисунке 27.

Рисунок 27 – Хроматограмма 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного (детектирование при длине волны 254 нм)

–  –  –

Как видно из представленных данных (рисунок 27 и таблица 27) в сборе нейропротективном обнаружены флавоноиды (байкалин, дигидрокверцетин, лютеолин-7-гликозид, рутин, кверцетин, эпигаллокатехингаллат, эпикатехин), фенолкарбоновые (галловая, вератровая), оксикоричные кислоты (хлорогеновая, кофейная, цикориевая, неохлорогеновая и феруловая кислоты), дубильные вещества (таннин) и кумарины (дикумарин, кумарин).

4.7.5. Идентификация свободных и связанных аминокислот, свободных углеводов, жирных кислот, компонентов эфирного масла Свободные и связанные аминокислоты Аминокислоты играют важную роль в биосинтезе биологически активных соединений, пептидов и белков [46].

По содержанию аминокислот можно судить о скорости протекания биохимических процессов. Лекарственные растения являются источниками БАВ, среди которых значительное место принадлежит аминокислотам. Свободные аминокислоты выполняют в живом организме ряд специфических задач, участвуя в процессах связывания, транспорта и выведения из организма биологически активных форм азота, способствуя поддержанию азотистого баланса, обладая иммуноактивными свойствами и оказывая гиполипидемическое действие. Они оказывают положительное влияние на сердечно - сосудистую систему, участвуют в процессах нервной регуляции различных функций организма, а также влияют на сосудистый тонус [91].

Качественный состав и количественное содержание аминокислот в сборе определяли на аминокислотном анализаторе (таблица 22) по выше приведенной методике (глава 2, п. 2.2, с. 42).

В результате проведенного исследования в сборе нейропротективном определены 21 свободная и 19 связанных аминокислот, среди которых 9 незаменимых аминокислот - треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, аргинин.

Суммарное содержание свободных аминокислот в сборе составляет 4,71 мг/г. В наибольшем количестве присутствуют аргинин – 41,92%, аспарагин – 22,15%, глютамин – 9,86% и глутаминовая кислота – 6,47% (от общего количества аминокислот). Суммарное содержание связанных аминокислот – 45,54 мг/г, среди которых преобладают аргинин – 15,82%, глутаминовая кислота – 12,41%, аспарагиновая кислота – 11,87%, цистеин – 9,77% (от общего количества аминокислот).

Свободные углеводы и органические кислоты Нами проведено исследование состава свободных углеводов и органических кислот в водном извлечении сбора нейропротективного методом ВЭЖХ.

Методика приготовления водного извлечения сбора нейропротективного.

Около 1 г (точная навеска) сбора, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 20 мл воды очищенной, присоединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания водной смеси в колбе. Полученное извлечение охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объём содержимого колбы до метки водой и перемешивали (исследуемый раствор).

По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения свободных углеводов и органических кислот вводили в хроматограф и хроматографировали по выше приведенной методике (глава 2, п. 2.2, с. 47). Результаты исследований приведены на рисунке 28 и в таблице 28.

Рисунок 28 - Хроматограмма водного извлечении сбора нейропротективного

–  –  –

Проведенный анализ показал, что в водном извлечении сбора нейропротективного присутствуют моносахариды (глюкоза, рамноза), дисахариды (сахароза, лактоза), органическая кислота (янтарная кислота) и многоатомный спирт (ксилит), среди которых в количественном отношении преобладает рамноза.

Жирные кислоты Полиненасыщенные жирные кислоты являются эссенциальными нутриентами. Они обладают выраженным антиатерогенным действием [70].

Регулярное дополнительное введение в рацион человека полиненасыщенных жирных кислот позволяет значительно снизить риск развития и прогрессирования заболеваний, вызванных атеросклерозом, таких как ишемическая болезнь сердца, дисциркуляторная энцефалопатия и облитирирующие заболевания артерий нижних конечностей. Экспериментальные исследования показали, что потребление матерью незаменимых полиненасыщенных жирных кислот во время беременности и лактации воздействует на поведение, показатели двигательных и когнитивных функций потомства [29].

Для извлечения общих липидов из сбора нейропротективного применяли модифицированный метод Блайя и Дайэра [199]. Анализ метиловых эфиров проводили методом ГХ-МС (рисунок 29 и таблица 29).

Рисунок 29 - Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот сбора нейропротективного (1 – пальмитиновая кислота, 2 – олеиновая кислота, 3 – линолевая кислота, 4 – -линоленовая кислота)

–  –  –

Результаты исследования компонентного состава общих липидов, выделенных из сбора, и процентное содержание жирных кислот представлены в таблице 29 и на рисунке 29. Анализ показал наличие 15 соединений – насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, их производные. Выявлено наибольшее содержание ненасыщенных – линолевой (42,80%), олеиновой (27,15%), линоленовой (3,07%) и насыщенных – пальмитиновой (9,35%) кислот.

Компонентный состав эфирного масла Эфирные масла – особая группа органических соединений. Они влияют на ключевые моменты роста и жизнедеятельности растений: служат для защиты от инфекций, теплорегуляции, способствуют за счет характерного запаха привлечению или отпугиванию насекомых.

Эфирные масла, как правило, являются сложной многокомпонентной смесью моно- и сесквитерпеноидов:

углеводородов, спиртов, альдегидов, кетонов, сложных эфиров, производных фенолов и других соединений, что обеспечивает их многогранные фармакологические свойства [8,16,173].

Количественное определение эфирного масла проводили из навески массой 50,0 г, согласно ГФ ХI изд., вып. 1, с. 290, метод 1. Содержание эфирного масла в сборе нейропротективном составило 0,08 %. Определение компонентов эфирного масла сбора выполняли методом ГХ-МС (глава 2, п. 2.2., с. 49). Результаты проведенного исследования приведены в таблице 30 и на рисунке 30.

Рисунок 30 - Хроматограмма эфирного масла сбора нейропротективного (1 – гексаналь, 2 - пинен, 3 - -мирцен, 4 - 3-карен, 5 – лимонен, 6 – ацетофенон, 7 – терпинолен, 8 – диметиловый эфир тимогидрохинона, 9 - -селинен, 10 – спатуленол, 11 - эвдесма-3,7(11)диен-8-он) Таблица 30 – Компонентный состав эфирного масла сбора нейропротективного

–  –  –

В результате проведенного исследования установлено, что эфирное масло сбора содержит 86 компонентов, из которых идентифицировано 74. Наибольшее количество составляют лимонен (52,17%), терпинолен (5,21%), -фелландрен (3,84%), эвдесма-3,7(11)-диен-8-он (3,58%), 3-карен (3,39%), -селинен (2,82%), мирцен (1,96%), ацетофенон (1,72%), п-цимол (1,47%), спатуленол (1,46%), пинен (1,40%). В эфирном масле сбора обнаружены 31 компонент, характерные для эфирного масла корневищ и корней вздутоплодника сибирского, а также 5

–  –  –

Как известно, дефицит Мg приводит к различным патологическим состояниям сердечно-сосудистой и нервной систем организма. Кроме того, при различных формах цереброваскулярных заболеваний отмечается дефицит Se, Mn, Zn и избыточное накопление Na, токсичных элементов. Препараты Мg оказывают нейропротективное действие засчет ингибирования глутаматных рецепторов, блокады эксайтотоксичности, улучшения процессов энергетического обмена, вазодилятации, снижения апоптоза нейронов и обеспечения более эфективной передачи сигнала в каскадах нейротрофических факторов [30].

Приведенные данные в таблице 31 свидетельствуют о том, что в составе сбора нейропротективного присутствуют макроэлементы К – 0,64%, Са – 0,43%, Mg – 0,26%, P – 0,14%, причем в наименьшем количестве присутствует Na – 0,03%. Микроэлементный состав сбора представлен 23 элементами, среди которых преобладают Fe – 244,00 мг/кг, Mn – 26,20 мг/кг, Zn – 17,50 мг/кг и B – 14,70 мг/кг. Полученные результаты подтверждают возможность использования сбора в составе комплексной терапии цереброваскулярных заболеваний.

4.7.7. Количественное содержание биологически активных веществ в сборе нейропротективном 4.7.7.1. Количественное определение суммы органических кислот Органические кислоты – значимая группа БАВ, которая встречается практически во всех растениях. Они обладают антиоксидантным, антигипоксическим, антиацидотическим, антикетогенным и антистрессорным действием, стимулируют стероидогенез, поддерживают транспорт кальция в организме, ослабляют токсическое действие некоторых лекарственных веществ через повышение детоксицирующей активности печени [36, 141]. Определение суммы органических кислот в сборе нейропротективном проводили титриметрическим методом в пересчёте на яблочную кислоту по ГФ ХI изд., вып.1, ст. 38 [26]. Метрологические характеристики методики представлены в таблице 32.

Таблица 32 – Метрологические характеристики методики количественного определения суммы органических кислот в сборе нейропротективном

–  –  –

Таким образом, содержание суммы органических кислот в сборе нейропротективном составляет 1,22±0,05 %.

4.7.7.2. Определение дубильных веществ Дубильные вещества обладают вяжущими, кровоостанавливающими, противовоспалительными, антимикробными и антиоксидантными свойствами.

Установлено, что гидролизуемые и конденсированные дубильные вещества проявляют высокую Р-витаминную активность, антигипоксическое и антисклеротическое действие. Для количественного определения дубильных веществ в сборе нейропротективном использовали комплексонометрический метод титрования [125]. Метрологические характеристики методики приведены в таблице 33.

Таблица 33 – Метрологические характеристики методики количественного определения дубильных веществ в сборе нейропротективном

–  –  –

В результате проведенного анализа установлено, что содержание дубильных веществ в сборе нейропротективном составляет 1,38±0,02%.

4.7.7.3. Определение аскорбиновой кислоты Аскорбиновая кислота обладает сильными антиоксидантными свойствами, что позволяет использовать ее совместно с нейропротекторами при комплексном лечении глаукомы. [190]. Для определения содержания аскорбиновой кислоты в сборе нейропротективном использована методика, приведенная в ФС 42-2668-95 на экстракт шиповника сухой. Методика основана на реакции окисления кислоты аскорбиновой фосфорномолибденовым реактивом и последующем спектрофотометрическом определении образующегося комплекса (рисунок 31) [126], ее метрологические характеристики приведены в таблице 34.

0,7 0,6 0,5 0,4

–  –  –

Рисунок 31 - Спектры поглощения продуктов взаимодействия сбора нейропротективного (водного извлечения) и аскорбиновой кислоты с фосфорномолибденовым реактивом

–  –  –

Таким образом, содержание аскорбиновой кислоты в сборе нейропротективном составляет 1,55±0,06%.

4.7.7.4. Количественное определение витаминов группы В в сборе нейропротективном и его компонентах Витамины группы В, прежде всего В1 (тиамин), В6 (пиридоксин), В12 (цианокобаламин), относятся к нейротропным и многие годы применяются в лечении заболеваний центральной и периферической нервной системы [109].

Определение содержания витаминов группы В в сборе нейропротективном проводили с помощью системы капиллярного электрофореза КАПЕЛЬ-105/105М (глава 2, п. 2.2, с. 49). Также данным методом исследовали исходные компоненты сбора. Результаты проведенного анализа представлены на рисунках 32 – 35 и в таблице 35.

Рисунок 32 - Электрофореграмма извлечения сбора нейропротективного Рисунок 33 - Электрофореграмма извлечения корней астрагала перепончатого Рисунок 34 - Электрофореграмма извлечения корней шлемника байкальского

–  –  –

Проведенные исследования показали, что сбор нейропротективный является богатым источником витаминов группы В, содержание витамина В1 составило 0,65·10-2%, В2 – 4,91·10-2%, В3 – 12,50·10-2%, В5 – 152,00·10-2%, В6 – 5,30·10-2%, Вс

– 2,70·10-2%.

4.7.7.5. Определение суммы восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса сбора Растительные полисахариды изучаются уже в течение длительного времени в связи с их ценными техническими свойствами и высокой физиологической активностью [78, 83, 112].

При определении количественного содержания полисахаридов в сборе применена спектрофотометрическая методика количественного определения полисахаридов в листьях мать-и-мачехи [9], основанная на способности моносахаридов, образовавшихся после гидролиза полисахаридного комплекса, восстанавливать в щелочной среде пикриновую кислоту до пикрамовой. В методику внесены изменения: степень измельчения сырья – 1 мм, 2-хкратная экстракция 70% спиртом -1 час и 30 минут – для максимального очищения сырья от флавоноидов (см. гл. 4, п. 4.8.1) и сапонинов. Кроме того, увеличен объем водного раствора А до 35 мл, для реакции комплексообразования использовался 0,05% водный раствор пикриновой кислоты, максимум оптической плотности наблюдался в области 460±2 нм (рисунок 36).

–  –  –

где D2 – оптическая плотность испытуемого раствора;

D1 – оптическая плотность раствора РСО глюкозы;

m2 – масса сбора нейропротективного, г;

m1 – масса РСО глюкозы в пересчете на безводную глюкозу, г;

W – влажность сбора нейропротективного, %.

Массу навески РСО глюкозы в пересчете на безводную глюкозу в граммах

–  –  –

Таким образом, содержание суммы восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса в сборе нейропротективном составляет 4,59±0,20 %.

4.7.7.6. Определение тритерпеновых сапонинов Тритерпеновые сапонины – сложные по структуре природные полициклические соединения гликозидного характера, состоящие из полярной углеводной части и неполярного агликона. Для лекарственного растительного сырья и препаратов, содержащих сапонины, характерно адаптогенное, отхаркивающее [52], диуретическое, нейролептическое, седативное, противовоспалительное [235], противовирусное [117], слабительное действие [87]. Они стимулируют и тонизируют центральную нервную систему [99].

Количественную оценку тритерпеноидов в сборе проводили спектрофотометрическим методом с использованием галохромной реакции тритерпеноидов с серной кислотой концентрированной[103]. Так как сбор содержит большое количество флавоноидов и кумаринов, во много раз превышающее содержание сапонинов, то при выполнении стандартных методик появляются дополнительные максимумы поглощения, мешающие количественному определению сапонинов в сборе (рисунок 37(2)), поэтому в методику введены дополнительные стадии очистки от флавоноидов (на стеклянной колонке с окисью алюминия) и кумаринов (жидкость - жидкостная экстракция с помощью 3% водного раствора Na2CO3).

Рисунок 37 - Спектры реакции взаимодействия сапонинов с концентрированной серной кислотой - хлороформного извлечения сбора нейропротективного и раствора РСО олеаноловой кислоты 1- после очистки извлечения от флавоноидов и кумаринов 2 – до очистки извлечения от флавоноидов и кумаринов Методика. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Около 5 г (точная навеска) измельченного сырья смачивали 5 - 6 мл 10% фосфорной кислоты и помещали в плоскодонную колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляли 50 мл хлороформа. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и экстрагировали на водяной бане при температуре 60°С в течение 60 минут. Извлечение фильтровали, фильтр предварительно промывали 10 мл хлороформа. Экстракцию повторяли еще дважды. Объединенные извлечения выпаривали досуха, растворяли в хлороформе, переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем раствора до метки хлороформом.

Далее из полученного извлечения отбирали аликвоту объемом 12,5 мл и помещали в делительную воронку, прибавляли 25 мл 3% водного раствора Na2CO3 и взбалтывали в течение 15 - 20 минут. После расслоения жидкостей из воронки удаляли нижний хлороформный слой. Оставшийся водный бикарбонатный экстракт подкисляли до рН = 3 - 4 с помощью 20% серной кислоты. Затем в воронку наливали 25 мл хлороформа и снова взбалтывали в течение 15-20 минут. После расслоения жидкостей из воронки сливали хлороформный слой в колбу через стеклянную колонку (h = 25 см, d = 2 см) c 10 г окиси алюминия для хроматографии II степени активности (по Брокману).

Хлороформный элюат упаривали на кипящей водяной бане примерно до объема 2 мл, остаток растворителя удаляли продуванием воздуха. Сухой остаток переносили 95% спиртом в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем раствора этим же растворителем до метки (раствор А). 4 мл раствора А выпаривали досуха на кипящей водяной бане, сухой остаток растворяли в 1 мл 95% спирта и прибавляли к нему 4 мл серной кислоты концентрированной, тщательно перемешивали. Через 10 минут измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 310±2 нм, раствор сравнения – серная кислота концентрированная.

Параллельно измеряли оптическую плотность раствора РСО олеаноловой кислоты в аналогичных условиях проведения эксперимента (к 1 мл раствора РСО олеаноловой кислоты прибавляли 4 мл серной кислоты концентрированной, тщательно перемешивали). Полученные спектры (220-450 нм) продуктов реакции суммы тритерпеновых сапонинов сбора и стандарта олеаноловой кислоты представлены на рисунке 37(1).

Содержание суммы тритерпеновых сапонинов в сборе в пересчете на олеаноловую кислоту и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляли по формуле:

D m0 25 25 1 100 100 D m0 5000 X ;

D0 m 12,5 4 25 (100 W ) D0 m (100 W ) где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 – оптическая плотность раствора РСО олеаноловой кислоты;

m– масса сбора нейропротективного, г;

m0 – масса РСО олеаноловой кислоты, г;

W – влажность сбора нейропротективного, %.

Метрологические характеристики методики приведены в таблице 37.

Таблица 37 - Метрологические характеристики методики количественного определения тритерпеновых сапонинов в сборе нейропротективном

–  –  –

0.6 0.4 0,5 0.2

–  –  –

Около 10 г (точная навеска) измельченного сбора помещали в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 50 мл хлороформа и экстрагировали на водяной бане при температуре 60°C с обратным холодильником в течение 1 часа.

Извлечение фильтровали через бумажный фильтр в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию повторяли еще дважды. Полученные объединенные извлечения упаривали на водяной бане до объема 5 мл, а затем под вакуумом досуха, остаток растворяли в 95% спирте и количественно переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем 95% спиртом до метки.

Полученный раствор использовали для нанесения на пластину Sorbfill в объеме 0,5 мл в виде полосы длиной 1 см. Параллельно на расстоянии 3 см от анализируемого раствора наносили раствор ГСО фловерина в объеме 0,5 мл в виде полосы длиной 1 см. Далее пластину помещали в систему гексан-бензолметанол (5:4:1) и при достижении фронта растворителя 10 см вынимали из камеры и сушили на воздухе до исчезновения запаха растворителей. После чего пластинку просматривали в УФ-свете при 360 нм и отмечали зоны, содержащие дигидросамидин и виснадин. Силикагель с отмеченных зон извлечения и контроля количественно переносили в мерные колбы вместимостью 50 мл, приливали 20-30 мл 95% спирта, закрывали колбы крышками, перемешивали на «вибрационном встряхивателе» в течение 2 ч. Доводили растворы в колбах до меток 95% спиртом, перемешивали и фильтровали через беззольные фильтры.

Измеряли оптическую плотность фильтратов на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при 322±2 нм, раствор сравнения – 95% спирт.

Содержание суммы дигидросамидина и виснадина в сборе в пересчете на фловерин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D m0 5000 D m0 25 25 1 100 100 X ;

D0 m 12,5 4 25 (100 W ) D0 m (100 W ) где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 – оптическая плотность раствора ГСО фловерина;

m – масса сбора нейропротективного, г;

m0 – масса ГСО фловерина, г;

W – влажность сбора нейропротективного, %.

Метрологические характеристики методики приведены в таблице 38.

Таблица 38 - Метрологические характеристики методики количественного определения кумаринов в сборе нейропротективном

–  –  –

Таким образом, установлено содержание кумаринов (сумма дигидросамидина и виснадина) в сборе нейропротективном - 0,80±0,03% %.

4.8. Стандартизация и разработка нормативной документации на сбор нейропротективный Для практического использования лекарственных средств необходимо решить комплекс вопросов, связанных с их стандартизацией и разработать на основе полученных данных соответствующую НД. В соответствии ОФС «Сборы»

[26] нами разработаны показатели качества сбора нейропротективного: 1) подлинность, включающая внешние признаки (морфологическеие признаки, характерные для компонентов сбора, запах и вкус водного извлечения), микроскопические признаки диагностические признаки), (анатомические качественные реакции и тонкослойная хроматография; 2) доброкачественность (содержание действующих веществ, влажность, зола общая и зола не растворимая в 10% растворе хлористоводородной кислоты, измельченность и содержание примесей); 3) стабильность сбора в процессе хранения в естественных условиях с измерением показателей качества в течение 2,5 лет с периодичностью 6 месяцев (срок годности сбора нейропротективного установлен в 2 года - Приложение 5).

Характерные внешние и микроскопические признаки сбора нейропротективного приведены в главе 4, п.4.5. и п.4.6.

Также для определения подлинности сбора нейропротективного разработаны методики качественных реакций и тонкослойной хроматографии обнаружения флавоноидов и свободных аминокислот:

- 2 г сбора помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 20 мл 60% спирта, присоединяют колбу к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Извлечение охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр. 2 мл полученного извлечения переносят в пробирку и прибавляют к нему 50 мг порошка металлического магния и 1 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, нагревают 5 минут на водяной бане. Появляется красно-оранжевое окрашивание (флавоноиды).

- 2 г сбора помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 20 мл воды очищенной, присоединяют колбу к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Извлечение охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, концентрируют в выпарительной чашке до 2 мл и переносят в пробирку. К извлечению прибавляют 4 капли 1% раствора нингидрина в 70% спирте, нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 минут. Появляется красно-фиолетовое окрашивание (аминокислоты).

- На линию старта хроматографической пластинки ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil»

размером 1515 см или 1015 см наносят дробно в первую точку 0,05 мл 60% спиртового извлечения сбора нейропротективного 1:10 (полученного на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа).

Рядом на расстоянии 3 см от первой точки во вторую точку наносят 0,005 мл раствора РСО байкалина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе и помещают в камеру со смесью растворителей хлороформ-метанол (60:40) и хроматографируют восходящим способом.

После прохождения фронтом растворителей 13 см, пластинку вынимают из камеры и высушивают на воздухе до удаления следов растворителей, опрыскивают 10% раствором серной кислоты и нагревают в сушильном шкафу при температуре 100С в течение 2 - 3 минут. На уровне зонысвидетеля должна обнаруживаться доминирующая оранжевая зона Rf ~ 0,19.

Допускается наличие других желтых зон.

- На линию старта хроматографической пластинки ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil»

размером 1515 см или 1015 см наносят дробно в первую точку 0,05 мл водного извлечения сбора нейропротективного 1:10 (полученного на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа и упаренного до объема, равного 1/4 первоначального объема).

Рядом на расстоянии 3 см от первой точки во вторую точку наносят 0,005 мл раствора РСО аргинина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе и помещают в камеру со смесью растворителей пропанол - вода (70:30) и хроматографируют восходящим способом. После прохождения фронтом растворителей 10 см, пластинку вынимают из камеры и высушивают на воздухе до удаления следов растворителей, опрыскивают 0,2% спиртовым раствором нингидрина и нагревают в сушильном шкафу при температуре 100С в течение 2 - 3 минут. На уровне зоны-свидетеля должна обнаруживаться доминирующая фиолетовая зона аргинина с Rf~0,06.

Допускается наличие других фиолетовых, розово-оранжевых зон.

В качестве критериев доброкачественности сбора нейропротективного предложены методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин и суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин, а также числовые показатели, полученные в результате товароведческого анализа сбора (глава 4, п. 4. 4).

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин в сборе нейропротективном Флавоноиды являются одним из классов растительных полифенолов, проявляющих разнообразную фармакологическую активность и придающих окраску растениям. В последнее время показано, что флавоноиды помимо антиоксидантного эффекта, проявляют противовоспалительный, противоаллергический, кардиопротекторный, антигипертензивный, гепатопротекторный, антибактериальный, противоопухолевый, эстрогенный и даже антиэстрогенный эффекты [95]. В качестве стандартного образца выбран байкалин, спектр поглощения которого находится в одной области 279±2 нм со

–  –  –

Для интенсификации процесса экстракции и полноты выхода флавоноидов изучены влияние времени и кратности экстракции (таблица 40).

Таблица 40- Содержание суммы флавоноидов в извлечениях сбора нейропротективного в зависимости от времени и кратности экстракции

–  –  –

Исходя из полученных данных установлены оптимальные условия анализа:

степень измельчения сырья – 1 мм, экстрагент – 60% спирт, соотношение сырье:

экстрагент – 1:100, температура проведения анализа – температура кипения водяной бани, кратность и время экстракции – 1 (1час).

Установленные в ходе экспериментов оптимальные параметры легли в основу методики количественного определения суммы флавоноидов в сборе нейропротективном и приведены в описании методики.

Методика 1. Аналитическую пробу сбора измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Около 1 г (точная навеска) измельченного сбора помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 60% спирта, взвешивают с погрешностью ± 0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и экстрагируют на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Колбу с содержимым охлаждают, взвешивают, доводят до первоначальной массы 60% спиртом.

Извлечение фильтруют через бумажный складчатый фильтр «красная лента», отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А). 0,5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора 60% спиртом до метки и перемешивают (раствор Б).

Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при

–  –  –

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 – оптическая плотность раствора РСО байкалина;

m – масса сбора нейропротективного, г;

m0 – масса РСО байкалина, г;

W – влажность сбора нейропротективного, %.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в сборе нейропротективном приведены в таблице 41.

Таблица 41- Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин в сборе нейропротективном

–  –  –

Относительная ошибка единичного определения не превышает 5%.

Установлена норма содержания суммы флавоноидов в пересчете на байкалин в сборе нейропротективном – не менее 6,0% (Приложение 5).

Данные, полученные в результате проведения валидации методики количественного определения суммы флавоноидов в сборе в пересчете на байкалин, позволяют оценить метод положительно по параметрам: линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность (Приложение 4) Разработка методики количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин в сборе нейропротективном Многие биологически активные добавки к пище и лекарственные средства, обладающие нейротропной активностью, представляют собой смесь аминокислот [46]. Нами разработана методика количественного определения суммы свободных аминокислот, основанная на нингидриновой реакции, характерной для находящихся в -положении аминогрупп и дающей при нагревании синее или фиолетовое окрашивание. Количественное определение суммы свободных аминокислот в сборе нейропротективном рассчитано по стандартному образцу аргинина, оптическая плотность которого измеряется параллельно с раствором исследуемого образца (рисунок 40).

–  –  –

Рисунок 40 - Спектры поглощения комплексов водного извлечения сбора нейропротективного и раствора РСО аргинина с 0,2% водным раствором нингидрина Выбор этой аминокислоты в качестве стандартного образца основан на спектрах поглощения комплексов аминокислот сбора и аргинина с нингидрином, а также данных ионообменной хроматографии (глава 4, п. 4.7.5.). При разработке

–  –  –

Для интенсификации процесса экстракции и полноты выхода свободных аминокислот из сбора нейропротективного изучено влияние времени и кратности экстракции (таблица 43).

Таблица 43 - Содержание суммы свободных аминокислот в зависимости от времени и кратности экстракции в извлечениях сбора нейропротективного

–  –  –

Установлено, что максимальная оптическая плотность фотометрической реакции достигается при использовании 1 мл извлечения сбора с 1 мл 0,2% водного раствора нингидрина, время нагревания полученной реакционной смеси

–  –  –

Методика 2. Аналитическую пробу сбора измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Около 1 г (точная навеска) измельченного сбора помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 150 мл воды очищенной, взвешивают с погрешностью ± 0,01 г. Содержимое колбы экстрагируют на водяной бане с обратным холодильником при температуре 90°C в течение 1 часа. Затем колбу с содержимым охлаждают, взвешивают, доводят до первоначальной массы водой очищенной.

Извлечение фильтруют через бумажный складчатый фильтр «красная лента», отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А).

В пробирку вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют к нему 2 мл ацетатного буфера 4,5, 2 мл 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты, 1 мл 0,2 % водного раствора нингидрина и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. После охлаждения раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и через 1 ч после начала реакции определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 568±2 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Параллельно проводят реакцию свежеприготовленного раствора РСО аргинина (1 мл) с 0,2 % водным раствором нингидрина (1 мл) в присутствии ацетатного буфера 4,5 (2 мл), 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты (2 мл) и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 568±2 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D 150 50 m0 1 100 D m0 15000 X 100 W D0 m 100 W ;

D0 m 1 100 50 где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 – оптическая плотность раствора РСО аргинина;

m – масса сбора нейропротективного, г;

m0 – масса РСО аргинина, г;

W – влажность сбора нейропротективного, %.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы свободных аминокислот в сборе нейропротективном приведены в таблице 46.

Таблица 46- Метрологические характеристики методики количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин в сборе нейропротективном

–  –  –

Относительная ошибка единичного определения не превышает 5%.

Установлена норма содержания суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин в сборе нейропротективном – не менее 3,0% (Приложение 5).

Данные, полученные в результате проведения валидации методики количественного определения суммы свободных аминокислот в сборе в пересчете на аргинин, позволяют оценить метод положительно по параметрам: линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность (Приложение 4).

Разработанные показатели качества, установленные при стандартизации сбора, включены в проект ФСП на сбор нейропротективный (Приложение 3).

Выводы к главе 4

1. На основании анализа сведений литературы, фитохимического и фармакологического скрининга обоснован состав и оптимальное соотношение компонентов сбора нейропротективного, включающего лекарственное растительное сырье: корни астрагала перепончатого, корни шлемника байкальского, корневища и корни вздутоплодника сибирского (40:35:25).

2. Разработана технологическая схема получения и определены числовые показатели сбора нейропротективного: экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 26,0%; золы общей не более 10,0%; золы, не растворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 5,0%;

влажность не более 10,0%; частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, не более 3,0%; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм, не более 5,0%; органической примеси не более 1,5%, минеральной примеси не более 2,0%.

3. Установлены анатомо-диагностические признаки сбора нейропротективного

– сетчатые сосуды древесины и бесцветные механические волокна корней астрагала перепончатого; клетки паренхимы (округлой формы, окрашенные в желтый цвет) и склереиды корней шлемника байкальского; клетки паренхимы (извилистой формы, бесцветные) и сосуды корней и корневищ вздутоплодника сибирского.

4. Качественными реакциями, а также методами БХ, ТСХ и ВЭЖХ подтверждено наличие в сборе флавоноидов (байкалин, дигидрокверцетин, лютеолин-7-гликозид, рутин, кверцетин, эпигаллокатехингаллат, эпикатехин), фенолкарбоновых (галловая, вератровая), оксикоричных (хлорогеновая, кофейная, цикориевая, неохлорогеновая и феруловая кислоты), и органических кислот (янтарная кислота), дубильных веществ (таннин), кумаринов (дикумарин, кумарин), тритерпеновых сапонинов, аминокислот, углеводов (лактоза, сахароза, глюкоза, рамноза), белковых веществ, водорастворимых полисахаридов, эфирных масел, аскорбиновой кислоты и алкалоидов.

5. В сборе нейропротективном обнаружено 15 жирных кислот, наибольшее содержание ненасыщенных – линолевой (42,80%), олеиновой (27,15%), линоленовой (3,07%) и насыщенных - пальмитиновой (9,35%) кислот.

6. В эфирном масле сбора нейропротективного (содержание масла в сырье 0,08%) идентифицировано 74 соединения, из них преобладают лимонен (52,17%), терпинолен (5,21%), -фелландрен (3,84%), эвдесма-3,7(11)-диенон (3,58%), 3-карен (3,39%), -селинен (2,82%), -мирцен (1,96%), ацетофенон (1,72%), п-цимол (1,47%), спатуленол (1,46%), -пинен (1,40%).

В эфирном масле сбора обнаружены 31 компонент, характерные для эфирного масла корневищ и корней вздутоплодника сибирского, а также 5 компонентов, содержащиеся в эфирном масле корней шлемника байкальского.

7. В сборе нейропротективном определены 21 свободная и 19 связанных аминокислот, среди них 9 незаменимых аминокислот (треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, аргинин), суммарное содержание свободных аминокислот в сборе составляет 4,71 мг/г, в наибольшем количестве присутствуют аргинин – 41,92%, аспарагин

– 22,15%, глютамин – 9,86% и глутаминовая кислота – 6,47% (от общего количества аминокислот); суммарное содержание связанных аминокислот – 45,54 мг/г, среди которых преобладают аргинин – 15,82%, глутаминовая кислота – 12,41%, аспарагиновая кислота – 11,87%, цистеин – 9,77% (от общего количества аминокислот).

8. Элементный состав сбора нейропротективного представлен макроэлементами К – 0,64%, Са – 0,43%, Mg – 0,26%, P – 0,14%, Na – 0,03%. Микроэлементный состав сбора включает 23 элемента, среди которых преобладают Fe – 244,00 мг/кг, Mn – 26,20 мг/кг, Zn – 17,50 мг/кг и B – 14,70 мг/кг; содержание азота общего - 1,42%.

9. 10. В сборе нейропротективном и его компонентах обнаружены витамины группы В (n*10-2%): в сборе В1 – 0,65, В2 – 4,91, В3 – 12,50, В5 – 152,00, В6 – 5,30, Вс – 2,70; в корнях астрагала перепончатого В2 – 0,20, В5 – 2,60, В6 – 3,88, Вс – 1,19; в корнях шлемника байкальского В1 – 1,79, В2 – 8,98, В3 – 35,85, В5 – 431,31, В6 – 9,43; в корневищах и корнях вздутоплодника сибирского В2 – 6,47, В6 – 1,39, Вс – 4,77.

10.Установлено количественное содержание БАВ в сборе нейропротективном:

органических кислот 1,22±0,05%, дубильных веществ 1,38±0,02%, аскорбиновой кислоты 1,55±0,06%, полисахаридов 4,59±0,20%, тритерпеновых сапонинов 0,06±0,01%, кумаринов 0,80±0,03%.

11. В сборе нейропротективном разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчёте на байкалин и суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин, относительные ошибки методик не превышают 5%; содержание флавоноидов и свободных аминокислот в сборе нейропротективном должно быть не менее 6,0% и 3,0% соответственно.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА «БРЭЙН-ПРОФИТ» ЭКСТРАКТА СУХОГО

И ЕГО СТАНДАРТИЗАЦИЯ

Растительные сборы наряду с многочисленными положительными свойствами обладают определенными недостатками: низкая стабильность, неполное извлечение биологически активных веществ, неудобство применения настоя из сбора. Поэтому нами разработан «Брэйн-профит» экстракт сухой – суммарный экстракционный препарат на основе сбора нейропротективного.

5.1. Оптимизация условий экстрагирования сбора нейропротективного При производстве сухих экстрактов первостепенное значение имеет процесс экстрагирования лекарственного растительного сырья.

В нашей работе изучены различные факторы, обеспечивающие наибольшую эффективность данного процесса: состав и природа экстрагента, его соотношение с сырьем, температурный режим, степень измельчения сырья, продолжительность и кратность числа экстракций. Количественная оценка велась по содержанию экстрактивных веществ (извлекаемых 60% спиртом), суммы флавоноидов в пересчете на байкалин и суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин.

Экстрагент, действуя как активный компонент системы, влияет на скорость, полноту и качество экстрагирования биологически активных веществ из растительного материала. В качестве экстрагентов были использованы вода и водно-спиртовые растворы различной концентрации. Результаты приведены в таблице 47.

Как видно из таблицы 47, с увеличением концентрации водно-спиртовых растворов повышается содержание суммы флавоноидов, экстрактивных веществ в извлечениях сбора и при 60% спирте достигает максимальных значений, поэтому в дальнейших исследованиях в качестве экстрагента выбран 60% спирт.

Таблица 47- Содержание экстрактивных веществ, флавоноидов, свободных аминокислот в извлечениях сбора нейропротективного в зависимости от типа экстрагента*

–  –  –

Используя для экстракции 60% спирт в различных соотношениях к количеству сырья 1:5, 1:7, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, получили соответствующие выходы экстрактивных веществ, флавоноидов и свободных аминокислот (таблица 48). Полученные данные свидетельствуют о том, что при соотношении сырья и экстрагента 1:10 и выше количество экстрагируемых веществ примерно одинаково, в этой связи нерационально увеличение объема экстрагента.

Таблица 48 - Содержание экстрактивных веществ, флавоноидов и свободных аминокислот в извлечениях сбора нейропротективного в зависимости от соотношения сырье: экстрагент*

–  –  –

Как известно, степень измельчения растительного материала является важным фактором повышения выхода действующих веществ и интенсификации процесса экстрагирования. На основании экспериментальных данных (таблица

49) для сбора нами выбрана степень измельчения 1 мм, которая обеспечивает максимальный выход суммы экстрактивных веществ.

Таблица 49 – Содержание экстрактивных веществ в извлечениях сбора нейропротективного в зависимости от размера частиц *

–  –  –

Также было исследовано влияние температурного режима на выход суммы экстрактивных веществ и действующих веществ (таблица 50). Полученные результаты свидетельствуют о том, что с увеличением температуры повышается выход БАВ и выбрана оптимальная температура 60°C-70°C.

Таблица 50- Содержание экстрактивных веществ, флавоноидов и свободных аминокислот в извлечениях сбора нейропротективного в зависимости от температурного режима экстракции*

–  –  –

измельченного сбора 60% спиртом на водяной бане при температуре 60°С. Через каждые 15 минут во время четырех контактов фаз отбирали по 25 мл извлечения для определения количества экстрактивных веществ, а также 1,5 мл для определения суммы флавоноидов и суммы свободных аминокислот.

Экспериментальные данные, представленные в таблице 51, свидетельствуют о том, что равновесное состояние во время I контакта фаз наступает через 60 минут, во время II – через 60 минут, во время III – через 60 минут. Как видно из таблицы 56, трехкратная экстракция обеспечивает максимальный выход как действующих, так и экстрактивных веществ.

В результате проведенных исследований установлены оптимальные условия экстрагирования сбора нейропротективного: экстрагент – 60% спирт, его соотношение к количеству сырья – 1:10, температурный режим – 60°С, степень измельчения сбора – 1 мм. Время I экстракции – 1 час, II – 1 час, III – 1 час.

Таблица 51- Содержание экстрактивных веществ, флавоноидов и свободных аминокислот в извлечениях сбора нейропротективного в зависимости от времени экстрагирования и количества экстракций

–  –  –

4.2. Технологическая схема получения «Брэйн-профит» экстракта сухого Технологическая схема получения экстракта сухого отработана с помощью лабораторного оборудования.

На всех стадиях технологического процесса проводили контроль исходного сбора, шрота, осадка балластных веществ после сепарирования, конечного продукта производства по разработанным методикам (на содержание суммы флавоноидов и суммы свободных аминокислот). Схема получения экстракта сухого представлена на рисунке 41.

–  –  –

Рисунок 41- Технологическая схема производства «Брэйн-профит» экстракта сухого

Основные стадии технологического процесса:

ВР 1. Подготовка персонала к работе.

ВР 2. Подготовка производственных помещений.

ВР 3. Подготовка оборудования.

ВР 4. Получение воды очищенной.

ТП 1. Измельчение растительного сырья.

ТП 2. Получение готового продукта.

УМО 1. Фасовка и упаковка «Брэйн-профит» экстракта сухого ТП 1. Измельчение растительного сырья.

Растительное сырье – сбор нейропротективный, состоящий из корней астрагала перепончатого, корней шлемника байкальского, корневищ и корней вздутоплодника сибирского измельчали на мельнице для размола сухих проб МРП-2 до размера частиц не более 1 мм.

После измельчения 1,05 кг сбора нейропротективного, содержащего 0,096 кг флавоноидов в пересчете на байкалин и 0,0318 кг свободных аминокислот в пересчете на аргинин, получили 1,00 кг измельченного сбора, содержащего 0,0917 кг флавоноидов в пересчете на байкалин и 0,0303 кг свободных аминокислот в пересчете на аргинин.

Потери сырья при измельчении составили 0,05 кг или 4,76%.

Выход на стадии – 95,24 %.

Выход от начала технологического процесса – 95,24%.

Измельченный сбор подавали на следующую стадию технологического процесса.

ТП 2.1. Приготовление 60% спирта и экстракция измельченного сбора.

В емкость объемом 50 л заливали 19,29 л 96,4% спирта, плотность 0,8058 г /см3 (18,60 л в 100% исчислении) и 12,66 воды очищенной, перемешивали 10-15 минут, затем брали пробу на анализ полученной водно-спиртовой смеси для определения его крепости.

Получали 31 л 60% спирта плотностью 0,909 г/см3, который использовали для извлечения экстрактивных веществ из измельченного сбора. Уменьшение объема смеси при смешивании спирта и воды составило 0,95 л, т.е. 2,97%. Для извлечения экстрактивных веществ из сбора нейропротективного допустимо использование 59-61% спиртовых растворов (плотность 0,9068 – 0,9112 г/см3).

Для приготовления 60% спирта использовали также отгон спирта, поступающий с операции ТП 2.3.

1,00 кг измельченного сбора, взвешенного на весах, загружали в экстрактор, заливали 12 л 60% спирта (соотношение сырье-экстрагент 1:12 с учетом коэффициента водопоглощения 2). Экстракцию проводили на водяной бане при температуре 60°С, температуру проверяли термометром в течение 60 минут, периодически экстрактор встряхивали для перемешивания.

По окончании экстракции первый водно-спиртовой экстракт в количестве 10 л (плотность 0,915 г/см3) с помощью давления, создаваемого водоструйным насосом фильтровали в колбу Бунзена и направляли на следующую стадию технологического процесса ТП 2.2. В экстрактор со шротом заливали 60% спирт в объеме равном объему слитого экстракта и снова экстрагировали в течение 60 минут. Получили 9,0 л второго экстракта (плотность 0,912 г/см3).

Аналогично проводили третью экстракцию в течение 60 минут. Получили 8,9 л третьего экстракта (плотность 0,912 г/ см3), который аналогично первому и второму экстракту передавали на стадию ТП 2.2.

После трехкратной экстракции в экстракторе остается 3,20 кг шрота с влажностью 74,72%, содержащего 0,00293 кг суммы флавоноидов в пересчете на байкалин и 0,00348 кг суммы аминокислот в пересчете на аргинин, считая на абсолютно сухое вещество. Шрот далее не использовали и направляли его в отвал.

ТП 2.2. Фильтрация экстракта Первый, второй и третий экстракты последовательно, по мере их получения, фильтровали с помощью водоструйного насоса в колбу Бюнзена из толстостенного стекла. Получили: первый экстракт в количестве 9,8 л, плотность 0,915 г/см3, второй экстракт 9,0 л; плотность 0,912 г/ см 3; третий экстракт 8,8 л;

плотность 0,912 г/см3.

ТП 2.3. Концентрирование экстракта После фильтрации на воронке Бюхнера первый, второй и третий водноспиртовые экстракты последовательно, порциями подавали на испаритель ротационный для упарки. Упарку вели при температуре реакционной массы (50±2)°С и давлении 0,01 кгс/см2 (9,81 гПа) приблизительно до 1/5 первоначального объема.

В результате упарки получили 3,94 л водного кубового остатка (плотность 1,040 г/см3) и 21,26 л отгона этилового спирта с содержанием 63,14% (13,42 л 100%), которые помещали в емкость и вновь использовали для приготовления 60% спирта. Водный кубовой остаток, содержащий действующие вещества сливали в сборник.

ТП 2.4. Сепарирование концентрированного экстракта Концентрированный экстракт очищали от балластных веществ сепарированием на сепараторе. Сепаратор промывали 0,2 л водой очищенной.

Получили очищенный экстракт в количестве 4,91 л (плотность 1,039 г/см 3) и осадок балластных веществ в количестве 0,08 кг (влажность 61,05%), который в дальнейшем не использовали. Очищенный экстракт сливали в сборник и передавали на следующую стадию технологического процесса.

ТП 2.5. Доупарка экстракта После очистки на сепараторе водный кубовой остаток помещали в выпарительную чашку на доупарку на водяной бане с температурой реакционной среды 60±2°С приблизительно до 1/3 первоначального объема. В результате доупарки получили 1,4 л концентрированного экстракта (плотность 1,17 г/см3).

Доупаренный водный экстракт, содержащий действующие вещества, сливали в эмалированную кювету и передавали на следующую стадию технологического процесса.

ТП 2.6. Сушка очищенного концентрированного экстракта.

Доупаренный концентрированный экстракт в эмалированной кювете сразу помещали в вакуумный сушильный шкаф, где сушили при температуре 65 - 70°С и давлении минус 0,98 - минус 1кгс/см2(минус 0,098 – минус 0,1 мПа) в течение 8 часов.

Получили экстракт сухой в количестве 0,28 кг.

Выход на стадии – 88,71% (по сумме флавоноидов) и 82,18% (по сумме свободных аминокислот).

Выход от начала технологического процесса – 84,48% (по сумме флавоноидов) и 78,30% (по сумме свободных аминокислот).

ТП 2.7. Измельчение готового продукта.

Высушенный продукт в количестве 0,28 кг измельчали в фарфоровой ступке, после чего измельченный «Брэйн-профит» экстракт сухой просеивали сквозь сито 0,25 мм и упаковывали в банки из темного стекла с навинчивающей крышкой.

Получено на стадии 0,272 кг «Брэйн-профит» экстракта сухого, потеря в массе при высушивании – 4,05%, содержание суммы флавоноидов – 30,28%, содержание суммы свободных аминокислот – 9,26%.

Выход на стадии – 97,11% (по сумме флавоноидов) и 97,19% (по сумме свободных аминокислот).

Выход от начала технологического процесса – 82,04% (по сумме флавоноидов) и 76,10% (по сумме свободных аминокислот).

Полученный готовый продукт – экстракт сухой после его анализа на соответствие ФС (проект ФС – приложение 3) расфасовывали по 0,05 или 0,1 кг в банки оранжевого стекла по ГОСТу.

«Брэйн-профит» экстракт сухой представляет собой аморфный порошок от светло - коричневого до темно - коричневого цвета со специфическим запахом, горьковатого слегка вяжущего вкуса. Гигроскопичен, слегка комкуется.

Растворим в спиртовых растворах (40% - 70%), в горячей воде. Потеря в массе при высушивании не должна превышать 5,0%

5.3. Определение качественного состава и количественного содержания биологически активных веществ «Брэйн-профит» экстракта сухого С целью исследования химического состава полученного экстракта сухого проведен качественный анализ на содержание основных групп БАВ. В качестве объектов исследования использовали 5 серий экстракта сухого, полученных в лабораторных условиях.

Идентификацию БАВ вели по методикам, описанным в главе 3, п. 3.4.1.

Экспериментально подтверждено содержание в экстракте сухом групп БАВ, содержащихся в сборе нейропротективном: флавоноидов, аминокислот, дубильных веществ, сапонинов, кумаринов, углеводов, органических кислот, аскорбиновой кислоты.

5.3.1. Идентификация фенольных соединений методом ВЭЖХ Фенольные соединения являются важными составляющими «Брэйнпрофит» экстракта сухого, которые определяют его фармакологическую активность. Идентификацию фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ.

Методика приготовления 70% спиртового извлечения экстракта сухого.

Около 0,5 г (точная навеска) экстракта сухого помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 20 мл 70% спирта, присоединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 5-10 минут с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили 70% спиртом до метки (раствор А). 5 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили тем же растворителем до метки (исследуемый раствор).

По 50 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали по выше приведенной методике (глава 2, п.

2.2, с. 47).

Результаты проведенных исследований приведены в таблице 52 и на рисунке 42.

Рисунок 42 – Хроматограмма 70% спиртового раствора «Брэйн-профит» экстракта сухого (детектирование при длине волны 254 нм) Таблица 52 - Компонентный состав фенольного комплекса «Брэйн-профит» экстракта сухого

–  –  –

Полученные данные (рисунок 42 и таблица 52) свидетельствуют о наличии в экстракте сухом флавоноидов (эпикатехин, эпигаллокатехингаллат, дигидрокверцетин, лютеолин-7-гликозид, рутин, байкалин, кверцетин, лютеолин), фенолкарбоновых (галловая, вератровая), оксикоричных кислот (о-кумаровая, протокатехиновая, хлорогеновая, кофейная, ванилиновая, цикориевая, неохлорогеновая, феруловая, п-анисовая), кумаринов (дикумарин, кумарин, ометоксикумарин).

5.3.2. Определение углеводов Определение содержания свободных углеводов в экстракте сухом проводили с использованием системы капиллярного электрофореза "КАПЕЛЬ 105/105М" (глава 2, п. 2.2, с. 49). Полученные данные представлены на рисунке 43 и в таблице 53.

Рисунок 43 - Электрофореграмма извлечения «Брэйн-профит» экстракта сухого Таблица 53 - Содержание свободных углеводов в «Брэйн-профит» экстракте сухом

–  –  –

Содержание полисахаридов, определенных гравиметрическим методом [26], составило 13,93±0,21 %.

5.3.3. Определение аминокислотного состава Определение аминокислот в экстракте сухом проводили на аминокислотном анализаторе (таблица 54) по выше приведенной методике (глава 2, п. 2.2, с. 42).

Таблица 54 - Содержание свободных и связанных аминокислот в «Брэйн-профит»

экстракте сухом

–  –  –

Таким образом, в экстракте сухом определены 21 свободная и 18 связанных аминокислот, среди которых 9 незаменимых аминокислот (треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, аргинин).

Суммарное содержание свободных аминокислот в экстракте составляет 9,36 мг/г.

–  –  –

Содержание азота общего, определенного фотоколориметрическим методом, составило 2,48%.

Как следует из представленных в данных, «Брэйн-профит» экстракт сухой богат макро- и микроэлементами. Макроэлементы представлены K – 1,84%, Mg – 0,46%, P – 0,20 %, Ca – 0,12%, Na – 0,11%. Cреди микроэлементов преобладают Zn – 22,80 мг/кг, B – 21,20 мг/кг, Fe – 19,20 мг/кг, Cu – 11,40 мг/кг. Токсичные элементы обнаружены в пределах допустимых значений. Анализ данных по минеральному составу сбора (глава 4, п. 4.7.6.) и экстракта сухого показал, что большая часть макро- и микроэлементов переходит при экстракции из растительного сырья в готовую лекарственную форму.

5.3.5. Исследование липидной фракции Для исследования липидной фракции экстракта сухого использовали метод хромато-масс-спектрометрии [59, 124].

Методика. Около 40 мг (точная навеска) экстракта сухого помещали в виалу для анализа, прибавляли 400 мкл 1М НСl/ CH3OH (1мл HCl конц. + 9 мл CH3OH). Помещали виалу с закрытой крышкой в термостат на 45 минут при температуре 80°C. Виалу охлаждали, прибавляли 400 мкл гексана и тщательно встряхивали в течение 5 - 10 минут. Далее содержимому виалы давали отстояться в течение 5 - 15 минут и аккуратно с помощью пипетки отделяли верхний слой жидкости от нижнего. Верхний слой жидкости помещали в другую виалу и упаривали при открытой крышке в термостате до сухого остатка при температуре 80°C. Далее к сухому остатку добавляли 20 мкл БТСФА (N,O – бис (триметилсилил) трифторацетамида), закрывали крышкой и помещали в термостат на 15 минут при температуре 80°C. После охлаждения виалы добавляли 80 мкл гексана и анализировали на газовом хроматографе с массспектрометрическим детектированием.

Полученные данные, представленные на рисунке 44 и в таблицах 56 – 58 свидетельствуют о наличии в экстракте жирных кислот, стероидных соединений и тритерпеновых сапонинов. Также идентифицированы 16 соединений, относящиеся к классу кумаринов, из них 13 имеют характерную химическую структуру пиранокумаринов. Качественный анализ основан на сравнении времен удерживания, а также полных масс-спектров, библиотек хромато-массспектрофотометрических данных NIST 08 и NIST 11. Процентный состав липидной фракции вычисляли по площадям газохроматографических пиков без использования корректирующих коэффициентов.

Рисунок 44 - Хроматограмма метиловых эфиров и триметилсилилпроизводных липидной фракции «Брэйн-профит» экстракта сухого

–  –  –

5.3.6. Определение кумаринов Для определения кумаринов в экстракте сухом использовали метод ВЭЖХ.

Методика. Около 0,25 г (точная навеска) экстракта сухого помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливали 20 мл 60% спирта, присоединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объёмом 25 мл и доводили 60% спиртом до метки (исследуемый раствор).

По 50 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения кумаринов (растворы Б) вводили в хроматограф и хроматографировали по выше приведенной методике (глава 2, п. 2.2, с. 48).

Количественное определение пеуцинидина, фловерина проводили используя диодно-матричный детектор, умбеллиферона - тандемный массспектрометрический детектор «ионная ловушка» 6330.

Результаты проведенных исследований приведены на рисунках 45 - 48 и в таблице 59.

–  –  –

Таким образом, в экстракте сухом количественно определены сумма дигидросамидина и виснадина - 54,50·10-2 %, пеуцинидин - 3,92·10-2 %, умбеллиферон – 0,86·10-2 %.

5.3.7. Определение витаминов группы В Определение содержания витаминов группы В в экстракте сухом проводили с помощью системы капиллярного электрофореза "КАПЕЛЬ-105/105М (глава 2, п.

2.2, с. 49). Результаты проведенного анализа представлены на рисунке 49 и в таблице 60.

Рисунок 49 - Электрофореграмма извлечения из экстракта сухого «Брэйн-профит»

–  –  –

Как видно из таблицы 60, в экстракте сухом присутствуют витамины группы В, характерные для сбора нейропротективного, что говорит о полноценном переходе исходных БАВ в готовую лекарственную форму.

5.3.8. Определение аскорбиновой кислоты Определение проводили по модифицированной методике ФС 42-2509-87 «Экстракт шиповника сухой».

–  –  –

Таким образом, содержание аскорбиновой кислоты в экстракте сухом составляет 3,32±0,15%.

5.3.9. Определение дубильных веществ Определение дубильных веществ в экстракте сухом проводили перманганометрическим методом в пересчете на таннин по ГФ XI, вып. 1, с. 286 [26].

Методика. Около 0,4 г (точная навеска) экстракта сухого помещали в коническую колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляли 50-60 мл воды очищенной, присоединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили водой до метки. Далее проводили количественное определение согласно методики ГФ.

Метрологические характеристики методики представлены в таблице 62.

Таблица 62 – Метрологические характеристики методики количественного определения дубильных веществ в «Брэйн-профит» экстракте сухом

–  –  –

Таким образом, содержание дубильных веществ в экстракте сухом составляет 7,62±0,19%.

5.3.10. Определение суммы органических кислот Определение суммы органических кислот в экстракте сухом проводили титриметрическим методом в пересчёте на яблочную кислоту по ГФ ХI изд., вып.1, ст. 38 [26]. Метрологические характеристики представлены в таблице 63.

Таблица 63 - Метрологические характеристики методики количественного определения органических кислот в «Брэйн-профит» экстракте сухом

–  –  –

Полученные данные свидетельствуют о том, что содержание суммы органических кислот в экстракте сухом составляет 8,22±0,15%.

5.4. Стандартизация и разработка нормативной документации на «Брэйн-профит» экстракт сухой Для внедрения «Брэйн-профит» экстракта сухого в медицинскую практику проведена его стандартизация и разработан проект фармакопейной статьи предприятия.

Для определения подлинности экстракта предложены такие показатели, как описание внешнего вида, методики качественных реакций и тонкослойной хроматографии определения флавоноидов и свободных аминокислот.

Качественные реакции. 0,5 г экстракта сухого растворяют в 20 мл 60% спирта, перемешивают до растворения. К 2 мл раствора прибавляют 50 мг порошка металлического магния и1 мл хлористоводородной кислоты концентрированной и нагревают на водяной бане 5 минут. Появляется краснооранжевое окрашивание (флавоноиды); К 2 мл раствора прибавляют 4 капли 1% раствора нингидрина в 70% спирте, нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 минут. Появляется красно-фиолетовое окрашивание (аминокислоты).

Хроматография. На линию старта хроматографической пластинки ПТСХПА-УФ «Sorbfil» размером 1515 см или 1015 см наносят дробно в первую точку 0,05 мл 60% спиртового раствора экстракта сухого 1:20. Рядом на расстоянии 3 см от первой точки во вторую точку наносят 0,005 мл раствора РСО байкалина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе и помещают в камеру со смесью растворителей хлороформ-метанол (60:40) и хроматографируют восходящим способом. После прохождения фронтом растворителей 13 см, пластинку вынимают из камеры и высушивают на воздухе до удаления следов растворителей, опрыскивают 10% раствором серной кислоты и нагревают в сушильном шкафу при температуре 100С в течение 2 - 3 минут. На уровне зоны-свидетеля должна обнаруживаться доминирующая оранжевая зона Rf~0,19. Допускается наличие других желтых зон.

На линию старта хроматографической пластинки ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil»

размером 1515 см или 1015 см наносят дробно в первую точку 0,05 мл водного раствора экстракта сухого 1:20. Рядом на расстоянии 3 см от первой точки во вторую точку наносят 0,005 мл раствора РСО аргинина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе и помещают в камеру со смесью растворителей пропанол - вода (70:30) и хроматографируют восходящим способом. После прохождения фронтом растворителей 10 см, пластинку вынимают из камеры и высушивают на воздухе до удаления следов растворителей, опрыскивают 0,2% спиртовым раствором нингидрина и нагревают в сушильном шкафу при температуре 100С в течение 2 - 3 минут. На уровне зоны-свидетеля должна обнаруживаться доминирующая фиолетовая зона аргинина с Rf~0,06. Допускается наличие других фиолетовых, розово-оранжевых зон.

Для определения доброкачественности экстракта сухого предложены методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин и суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин.

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин в «Брэйн-профит» экстракте сухом Разработка методики количественного определения флавоноидов в экстракте сухом проводилась по принципу сквозной стандартизации на основе методики разработанной для исходного сбора. В качестве стандартного образца использовали РСО байкалина, так как максимумы поглощения 60% спиртовых растворов байкалина и экстракта сухого находятся в одной области 279±2 нм (рисунок 50).

–  –  –

Методика 1. Около 0,3 г экстракта сухого помещают в плоскодонную колбу со шлифом вместимостью 250 мл, добавляют 50-60 мл 60% спирта, присоединяют колбу к обратному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 минут, периодически перемешивая, охлаждают. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора 60% спиртом до метки (раствор А). 0,5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора 60% спиртом до метки, перемешивают. Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 279±2 нм. В качестве раствора сравнения используют 60% спирт.

Параллельно в тех же условиях измеряют оптическую плотность раствора РСО байкалина.

Содержание суммы флавоноидов в экстракте сухом в пересчете на байкалин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D m0 2 100 50 100 100 D m0 40000 X ;

D0 m 100 50 0,5 (100 W ) D0 m (100 W ) где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 – оптическая плотность раствора РСО байкалина;

m – масса экстракта сухого, г;

m0 – масса РСО байкалина, г;

W – потеря в массе при высушивании экстракта сухого, %.

Метрологические характеристики результатов количественного определения представлены в таблице 64.

Таблица 64 - Метрологические характеристики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин в «Брэйн-профит» экстракте сухом

–  –  –

Относительная ошибка единичного определения суммы флавоноидов в экстракте сухом не превышает 5%.

Таким образом, разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин в экстракте сухом, содержание суммы флавоноидов в экстракте должно быть не менее 24,0% (Приложение 5).

Данные, полученные в результате проведения валидации методики количественного определения суммы флавоноидов в экстракте сухом в пересчете на байкалин, позволяют оценить метод положительно по параметрам: линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность (Приложение 4) Разработка методики количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин в «Брэйн-профит» экстракте сухом Аминокислоты являются одной из основных групп биологически активных соединений, определяющих суммарное фармакологическое действие сбора и экстракта сухого «Брэйн-профит».

Разработана методика количественного определения суммы свободных аминокислот по принципу сквозной стандартизации аналогично методике количественного определения свободных аминокислот в сборе, основанная на нингидриновой реакции с образованием комплекса голубого цвета с максимумом поглощения при длине волны 568±2 нм. Количественное определение суммы свободных аминокислот в «Брэйн-профит» экстракте сухом рассчитано по стандартному образцу аргинина, оптическая плотность раствора которого измеряется параллельно с раствором исследуемого образца. Выбор этой аминокислоты в качестве стандартного образца основан на спектрах поглощения комплексов аминокислот экстракта и аргинина с нингидрином (рисунок 51) и данных ионообменной хроматографии (глава 5, п. 5.3.4.).

0,5

–  –  –

Рисунок 51 - Спектры поглощения комплексов водного раствора «Брэйн-профит»

экстракта сухого и раствора РСО аргинина с 0,2% водным раствором нингидрина Методика 2. Около 0,3 г (точная навеска) экстракта сухого помещают в плоскодонную колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 80 мл воды очищенной, нагревают на водяной бане при температуре 90°С с обратным холодильником в течение 15 минут. После охлаждения полученное извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный складчатый фильтр «красная лента», предварительно промытый 10-15 мл воды очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают (раствор А).

В пробирку вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют к нему 2 мл ацетатного буфера 4,5, 2 мл 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты, 1 мл 0,2% водного раствора нингидрина и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. После охлаждения раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и через 1 ч после начала реакции измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 568±2 нм.

Параллельно проводят реакцию свежеприготовленного раствора РСО аргинина (1 мл) с 0,2% водным раствором нингидрина (1 мл) в присутствии ацетатного буфера 4,5 (2 мл), 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты (2 мл) и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 568±2 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание суммы свободных аминокислот в экстракте сухом в пересчете на аргинин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

–  –  –

суммы свободных аминокислот в экстракте приведены в таблице 65.

Таблица 65 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин в «Брэйн-профит» экстракте сухом

–  –  –

Таким образом, разработана методика количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин в «Брэйн-профит» экстракте сухом, содержание суммы свободных аминокислот в экстракте должно быть не менее 7,5% (Приложение 5).

Данные, полученные в результате проведения валидации методики количественного определения суммы свободных аминокислот в экстракте сухом в пересчете на аргинин, позволяют оценить метод положительно по параметрам:

линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность (Приложение 4) Установление сроков годности «Брэйн-профит» экстракта сухого Для определения сроков годности четыре серии образцов экстракта сухого были заложены на хранение в естественных условиях (в сухом, защищенном от света месте, при комнатной температуре). Показатели качества определяли через каждые 6 месяцев. На основании данных по стабильности экстракта в процесе хранения, срок годности экстракта сухого установлен в 2 года, что подтверждено результатами изучения стабильности средства в течение 2,5 лет (Приложение 5).

Разработанные показатели качества, установленные при стандартизации экстракта сухого, включены в проект ФСП на «Брэйн-профит» экстракт сухой (Приложение 3).

Выводы к главе 5

1. Установлены оптимальные условия экстрагирования сбора нейропротективного для получения экстракта сухого: экстрагент – 60% спирт, соотношение сырье: экстрагент – 1:10(12), степень измельчения сбора – 1 мм, температура экстрагирования - 60°С, продолжительность I контакта фаз – 60 минут, II контакта фаз – 60 минут, III контакта фаз – 60 минут; разработана технологическая схема получения «Брэйн-профит»

экстракта сухого.

2. Качественный состав экстракта сухого показал присутствие полисахаридов, флавоноидов, дубильных веществ, аминокислот, кислоты аскорбиновой, сапонинов, витаминов группы В.

3. В экстракте сухом «Брэйн-профит» идентифицированы флавоноиды (эпигаллокатехингаллат, эпикатехин, дигидрокверцетин, лютеолин-7гликозид, рутин, байкалин, кверцетин, лютеолин), фенолкарбоновые (галловая, протокатеховая, ванилиновая, п-анисовая, вератровая), гидроксикоричные кислоты (о-кумаровая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, неохлорогеновая, феруловая), и аскорбиновая кислоты, кумарины (дикумарин, кумарин, о-метоксикумарин), таннин.

4. Липидная фракция «Брэйн-профит» экстракта сухого содержит 75 соединений, из них 45 отнесены к жирным кислотам, 16 – к кумаринам, 6 – к стероидам, 5 – производным тритерпеновых сапонинов.

5. Определен аминокислотный состав «Брэйн-профит» экстракта сухого, обнаружены 21 свободная и 18 связанных аминокислот, среди них 9 незаменимых аминокислот треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, аргинин; суммарное содержание свободных аминокислот в экстракте составляет 9,36 мг/г, в наибольшем количестве присутствуют аргинин – 41,91%, аспарагин – 21,51%, глютамин – 10,35% и глутаминовая кислота – 7,12% (от общего количества аминокислот);

суммарное содержание связанных аминокислот – 28,77 мг/г, среди которых преобладают аргинин – 31,51%, аспарагиновая кислота – 25,57%, глутаминовая кислота – 17,58%, цистеин – 6,52% (от общего количества аминокислот).

6. В экстракте сухом обнаружены макроэлементы: K – 1,84%, Mg – 0,46%, P – 0,20 %, Ca – 0,12%, Na – 0,11%, среди микроэлементов преобладают: Zn – 22,80 мг/кг, B – 21,20 мг/кг, Fe – 19,20 мг/кг, Cu – 11,40 мг/кг; содержание азота общего - 2,48%.

7. Установлено количественное содержание БАВ в экстракте сухом:

аскорбиновой кислоты 3,32±0,15%, дубильных веществ 7,62±0,19%, органических кислот 8,22±0,15%, полисахаридов 13,93±0,21%.

8. Для стандартизации «Брэйн-профит» экстракта сухого разработаны и валидированы методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин и суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин, содержание которых должно быть не менее 24,0% и 7,5% соответственно.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Для растительного сырья – корней астрагала перепончатого установлены особенности строения, необходимые для подтверждения его подлинности:

макроскопические признаки - корни стержневые, ветвистые до 4 см толщиной, одревесневшие, волокнистые, поверхность продольно-морщинистая, от сероватожелтого до желтовато-бежевого цвета; микроскопические признаки – наличие хорошо развитой многорядной пробки, паренхимы, бесцветных и оранжеватожелтых механических волокон с характерными утолщенными стенками и продольными трещинами, сетчатых сосудов древесины, каменистых клеток изодиаметрической или вытянутой формы с утолщенными, бороздчатыми стенками и простых крахмальных зерен; определены качественный состав и количественное содержание БАВ (флавоноиды, свободные аминокислоты 10,28±0,30%, тритерпеновые сапонины 1,51±0,04%, органические кислоты 1,96±0,03%, дубильные вещества 0,44±0,02%, углеводный комплекс: СУ – 9,23%, ВРПС – 8,32%, ПВ – 7,02%, Гц А – 13,17%, Гц А – 2,12%; жирные кислоты, элементный состав).

2. Экспериментально обоснован и предложен рациональный состав сбора нейропротективного: корней астрагала перепончатого – 40 ч, корней шлемника байкальского – 35 ч, корневищ и корней вздутоплодника сибирского – 25 ч, для которого установлены диагностически значимые признаки, заключающиеся в особенностях строения сосудов древесины и механических волокон корней астрагала перепончатого; клеток паренхимы (округлой формы, окрашенные в желтый цвет) и склереид корней шлемника байкальского; клеток паренхимы (изогнутой формы формы, бесцветные) и сосудов корневищ и корней вздутоплодника сибирского; нормированы товароведческие показатели сбора, определен качественный состав БАВ и их количественное содержание:

флавоноидов 9,67±0,32%, свободных аминокислот 3,66±0,18%, кумаринов 0,80±0,03%, тритерпеновых сапонинов 0,06±0,01%, полисахаридов 4,59±0,20%;

органических кислот 1,22±0,05%, дубильных веществ 1,38±0,02%, аскорбиновой кислоты 1,55±0,06%, эфирных масел, жирных кислот, свободных углеводов, макро- и микроэлементов.

Оптимизированы режимы экстракции сбора нейропротективного, 3.

обеспечивающие максимальный выход БАВ: экстрагент – спирт, 60% соотношение сырье: экстрагент – 1:10(12), степень измельчения сбора – 1 мм, температура экстрагирования - 60°С, продолжительность I контакта фаз – 60 минут, II контакта фаз – 60 минут, III контакта фаз – 60 минут; разработана технология получения «Брэйн-профит» экстракта сухого, определен его химический состав: флавоноидов 30,28±0,49%, свободных аминокислот 9,26±0,34%, полисахаридов 13,93±0,21%; органических кислот 8,22±0,15%, дубильных веществ 7,62±0,19%, аскорбиновой кислоты 3,32±0,15%, исследованы жирные кислоты, липидная фракция, макро- и микроэлементы.

Разработаны показатели стандаризации для корней астрагала 4.

перепончатого: влажность не более 8,0%; экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 20,0%, золы общей не более 10,0%; золы, не растворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 6,0%; органических примесей не более 0,5%; минеральных примесей не более 1,0%; для сбора нейропротективного: влажность не более 10,0%, экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 26,0%; золы общей не более 10,0%; золы, не растворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 5,0%;

частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, не более 3,0%;

частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм, не более 5,0%;

органической примеси не более 1,5%, минеральной примеси не более 2,0%; для «Брэйн-профит» экстракта сухого: влажность не более 5,0%, содержание тяжелых металлов не более 0,01%. Количественная оценка велась по сумме свободных аминокислот в пересчете на аспарагин для корней астрагала перепончатого, по сумме флавоноидов в пересчете на байкалин и по сумме свободных аминокислот в пересчете на аргинин - для сбора нейропротективного и «Брэйн-профит»

экстакта сухого.

5. Разработаны и представлены проект Фармакопейной статьи (ФС) на корни астрагала перепончатого, проекты Фармакопейных статей предприятий (ФСП) на сбор нейропротективный и «Брэйн-профит» экстракт сухой, лабораторные регламенты на производство сбора нейропротективного и «Брэйнпрофит» экстракта сухого.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абышев, А. З. Химия и фармакология природных кумаринов / А. З. Абышев, Э. М. Агаев, Ю. Б. Керимов // Баку: «Caspian Supplies», 2003. – 112 с.

2. Аладышева, Ж. И. Практические аспекты работ по валидации аналитических методик / Ж. И. Аладышева, В. В. Беляев, В. В. Береговых // Фармация. – 2008. – № 7. – С. 9 – 14.

3. Антонова, О. К. Кумарины корней Phlojodicarpus sibiricus / О.К. Антонова, Б.В. Шемерянкин // Химия природных соединений. – 1981.– № 6. – С. 797 – 798.

4. Арзамасцев, А. П. Валидация аналитических методов / А. П. Арзамасцев, Н.

П. Садчикова, Ю. Я. Харитонов // Фармация. – 2006. – № 4 – С. 8 – 12.

5. Арушанян, Э. Б. Ноотропные свойства препаратов Гинкго билоба / Э. Б.

Арушанян // Экспер. и клин. фармакол. – 2008. – Т. 71, № 4. – С. 37 – 63.

6. Бабилев, Ф. Б. Кумарины корней Phlojidicarpus villosus Turcz. / Ф. Б. Бабилев, Г. К. Никонов // Химия природных соединений. – 1965. – № 5. – С. 353 – 356.

7. Баторова, С. М. Лекарственные растительные средства, применяемые при лечении болезней легких в практике тибетской медицины Монголии / С. М.

Баторова // Растительные ресурсы. – 2001. – Т. 37, Вып. 1. – С. 46 – 48.

8. Белоусова, Н. И. Химический состав эфирного масла багульников / Н. И.

Белоусова, В. А. Хан, А. В. Ткачев // Химия растительного сырья. – 1999. – № 3. – С. 5 – 38.

9. Беляков, К. В. Количественное определение полисахаридов в листьях матьи-мачехи (Tussilago farfara L.) / К. В. Беляков, Д. М. Попов // Фармация. – 1999. – № 1. – С. 23 – 24.

10. Бубенчикова, В. Н. Изучение полисахаридного и минерального состава травы шалфея мутовчатого (Salvia verticillata L.) / В. Н. Бубенчикова, Ю. А.

Кондратова // Химия растительного сырья. – 2008. – № 3. – С. 185 – 186.

11. Бухашеева, Т. Г. Эколого-биологические особенности Scutellaria baicalensis Georgi в Забайкалье: дис. … канд. биол. наук / Т. Г. Бухашеева. – Улан-Удэ, 2000. – 195 с.

12. Вавилова, Н. М. Гомеопатическая фармакодинамика: в 2 ч. / Н. М.

Вавилова. – М.: Медицинский центр «Эверест». – Ч. 1. – 1994.

13. Валидация аналитических методик для производителей лекарств. Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств, подготовленное Федеральным союзом фармпроизводителей Германии (ВАН), пер. Ж. И. Аладышевой, О. Р. Спицкого / Под ред. В. В. Береговых.

– М.: Литерра, 2008. – 132 с.

14. Васильева, О. Д. Вздутоплодник сибирский Phlojodicarpus sibiricus (Steph.

ex Spreng.) K.- Pol. в Якутии (Биология, интродукция, охрана): дис. …канд.

биол. наук / О. Д. Васильева. – Якутск, 2005. – 170 с.

15. Влияние на нейритный рост спинальных ганглиев эмбрионов цыплят этанольного экстракта вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus / А. Я. Шурыгин, Т. А. Асеева, Н. С. Скороход и др. // Успехи современного естествознания. – 2005. – № 10. – С. 90 – 91.

16. Воробьева, А. К. Биологическая активность эфирных масел орегано и чабера в опытах in vivo: дис. … канд. биол. наук / А. К. Воробьева. – М., 2014. – 136 с.

17. Воронина, Т. А. Ноотропные и нейропротекторные средства / Т. А.

Воронина, С. Б. Середенин // Экспер. и клин. фармакол. – 2007. – Т. 70, № 4.

– С. 44 – 58.

18. Всемирная организация здравоохранения. Неврологические нарушения:

задачи общественного здравоохранения / ВОЗ. – 2007. – 232 с.

19. Вторичная профилактика инсульта: взгдяд невролога / В. И. Скворцова, Л.

В. Стаховская, Н. А. Пряникова и др. // Болезни сердца и сосудов. – 2006. – № 3. – С. 17 – 20.

20. Гантимур, Д. Кумарины растений рода Phlojodicarpus: дисс. … канд. хим.

наук / Д. Гантимур. – Иркутск, Улан-Батор, 1985. – 88 с.

21. Гантимур, Д. Новые гликозиды из растений рода Phlojodicarpus / Д.

Гантимур, А. И. Сырчина, А. А. Семенов // Химия природных соединений. – 1986. – № 1. – С. 36 – 39.

22. Гилева, М. В. Возможности использования ресурсов Phlojodicarpus sibiricus (Steph. ex Spreng.) K.–Pol. в Читинской области / М. В. Гилёва // Проблемы сохранения разнообразия растительного покрова Внутренней Азии:

материалы Всеросс. науч. конфер. с междунар. участием. – Улан-Удэ, 2004.

– С. 81 – 82.

23. Гилева, М. В. Продуктивность особей Phlojodicarpus sibiricus (Steph. ex Spreng.) K.–Pol. (Apiaceae) в Даурии / М. В. Гилёва // Флора и растительность Даурии: исследования и охрана: сб. науч. статей. – Чита, 2004. – С. 64 – 69.

24. Гилёва, М. В. Сезонный ритм развития Phlojodicarpus sibiricus (Steph. ex Spreng.) K.–Pol. (Apiaceae) при интродукции в Восточном Забайкалье / М. В.

Гилёва // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии: материалы VII Международной научно-практической конференции. – Барнаул, 2008. – С.

49 – 50.

25. ГОСТ Р ИСО 5725-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений» в 6 ч. – Введ. 23.04.02. – М.: Госстандарт России; Издательство стандартов, 2002.

26. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1, 2. Общие методы анализа.

Лекарственное растительное сырье // МЗ СССР. 11-е изд., доп. М., вып. 1. – 1987. – 336 с., вып. 2. - 1989. – 400 с.

27. Государственная фармакопея Российской Федерации. 12-е изд. – ч. 1. – М.:

Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. – 704 с; – ч. 2. – М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2010. – 600 с.

28. Громакова, А. И. Разарботка методов количественного определения некоторых производных кумарина в растительном сырье и препаратах:

автореф. дис. … канд. фарм. наук. – М., 1982. – 17 с.

29. Громова, О. А. Нейропротективный эффект докозагексаеновой и эйкозопентаеновой полиненасыщенных жирных кислот и перинатальная защита мозга плода (клинико-фармакологическая лекция) / О. А. Громова, Н. В. Керимкулова // Гинекология. – 2011. – № 6. – С. 30 – 36.

30. Громова, О. А. Нейротрофическая система мозга: нейропептиды, макро- и микроэлементы, нейротрофические препараты / О. А. Громова // М. Н. Ж. – 2007. – № 2. – С. 15 – 25.

31. Гуляев, С. М. Анксиолитическое действие экстракта и настойки вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus) / C. М. Гуляев, С. М.

Николаев // Дальневосточный медицинский журнал. – 2010. – № 1. – С. 100

–102.

32. Гуляев, С. М. Влияние настойки вздутоплодника сибирского на когнитивные функции и нейропсихологический статус у больных с недостаточностью мозгового кровообращения / С. М. Гуляев, Т. М.

Санданов // Вестник СПбГУ. Серия 11. Медицина. – 2008. – № 3. – С. 44 – 49.

33. Гуляев, С. М. Защитное действие Phlojodicarpus sibiricus при ишемии головного мозга у крыс / С. М. Гуляев // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2009. – №3 (67). – С. 172 – 174.

34. Гуляев, С. М. Противотревожное действие Phlojodicarpus sibiricus / С. М.

Гуляев // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2009. – №3 (67). – С. 175 – 177.

35. Гуляев, С. М. Церебропротекторное действие настойки вздутоплодника сибирского при экспериментальной ишемии головного мозга / С. М. Гуляев, С. М. Николаев // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2008. – №3 (61). – С. 71 – 72.

36. Деримедведь, Л. В. БАДы на основе янтарной кислоты. Фармакологический анализ / Л. В. Деримедведь, В. А. Тимченко // Провизор. – 2002. – Вып. 13. – Режим доступа: http://www.provisor.com.ua/archive/2002/N13/art_39.php

37. Дубашинская, Н. В. Определение коэффициента спиртопоглощения корневищ с корнями синюхи / Н. В. Дубашинская, О. М. Хишова // Актуальные вопросы современной медицины и фармации. Материалы 58 итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых.

– Витебск. – 2006. – С. 192 –194.

38. Дубашинская, Н. В. Характеристика способов получения экстрактов и их стандартизация (часть II) / Н. В. Дубашинская, О. М. Хишова, О. М. Шимко // Вестник фармации. – 2007. – №2 (36). – С. 1 – 10.

39. Думенова, Е. М. Сравнительное действие пустырника, валерианы и шлемника байкальского на моторную хронаксию / Е. М. Думенова // Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты и применение. – Томск, 1959. – Вып. 6. – С. 93 – 97.

40. Живолупов, С. А. Современный клинический анализ цереброваскулярных заболеваний: узловые вопросы дифференциальной диагностики и патогенетического лечения / С. А. Живолупов, И. Н. Самарцев // Фарматека.

– 2012. – № 7. – С. 87 – 94.

41. Запасы сырья вздутоплодника сибирского в юго-восточном Забайкалье / М.

Г. Пименов, Л. С. Демидова, М. Е. Пименова, Л. И. Сдобнина // Растительные ресурсы. – 1976. – Т. 12, Вып. 3. – С. 329 – 339.

42. Захаров, В. В. Инсульт и когнитивные нарушения / В. В. Захаров, Н. В.

Вахнина // Неврология, нейропсихиатрия и психосоматика. – 2011. – № 2. – С. 8 – 16.

43. Изнак, А. Ф. Нейропротекторы в профилактике депрессивных расстройств / А. Ф. Изнак // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. – 2006. – № 5.

– С. 103 – 105.

44. Изучение содержания виснадина и дигидросамидина в сырье вздутоплодника сибирского / А. И. Громакова, А. П. Исайкина, Б. А.

Кривут, В. В. Вандышев // Хим – фарм. журнал. – 1982. – № 4. – С. 60 – 66.

45. Инсульт: диагностика, лечение, профилактика / под ред. З. А. Суслиной, М.

А. Пирадова. – М.: МЕДпресс-информ, 2009. – 288с.

46. Использование нингидриновой реакции для количественного определения

- аминокислот в различных объектах: методические рекомендации / А. В.

Симонян, А. А. Саламатов, Ю. С. Покровская, А. А. Аванесян. – Волгоград, 2007. – 106 с.

47. Кабанов, В. С. Газохроматографический метод количественного определения суммы виснадина и дигидросамидина в корнях вздутоплодника сибирского / В. С. Кабанов, А. И. Громакова, М. Е.

Перельсон // Хим. – фарм. журнал. – 1982. – Т. 16, № 12. – С. 1487 – 1490.

48. Кабанов, В. С. Газохроматографическое определение соотношения виснадина и дигидросамидина в их смесях / В. С. Кабанов, В. В. Вандышев // Химия природных соединений. – 1974. – № 6. – С. 711 – 714.

49. Камчатнов, П. Р. Когнитивные расстройства сосудистого генеза и возможности их коррекции / П. Р. Камчатнов, К. А. Зайцев, Б. А. Абусуева // Клиницист. – 2010. – № 1. – С. 69 – 73.

50. Кисилева, Т. Л. Роль Института гомеопатии и натуротерапии в развитии фитотерапии в России / Т. Л. Киселева, А. А. Карпеев // Здравоохранение. – 2009. – № 7. – С. 12 – 16.



Pages:     | 1 || 3 |
Похожие работы:

«Государственное бюджетное учреждение дополнительного образования "Белгородский областной детский эколого-биологический центр" Направление воспитательной работы "Воспитанник и его здоровье" "О чём рассказала ромашка" Познавательная программ...»

«УДК 728.3 БУДУЩЕЕ ЗА "ПАССИВНЫМ" ДОМОМ Исина Асем Зайсановна магистрант Евразийского национального университета имени Л.Н.Гумилева, г.Астана Научный руководитель – кандидат архитектуры, доцент Садыкова Сара Шангереевна "Пассивный" дом является не только конкретным типом проектирования строе...»

«Шлыков Сергей Николаевич ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОДУКТОВ МЯСНОГО СКОТОВОДСТВА НА ОСНОВЕ ПРОГРЕССИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ СЕЛЕКЦИИ И КОРМЛЕНИЯ ЖИВОТНЫХ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соиска...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровский государственный университет" Новокузнецки...»

«НОРМАЛИЗАЦИЯ НАРУШЕНИЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА У ДЕТЕЙ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА Пирогова З.И., Александрович Н.Ж. Одной из важнейших составляющих здоровья является состояние микробиоценоза организма человека. Дисбиоз кишечника представляет собой клинико-микробиологический синдром, в...»

«Биокарта Tylototriton verrucosus ГИМАЛАЙСКИЙ ТРИТОН Tylototriton verrucosus Himalayan Knobby Newt, Crocodile Newt, Alligator Newt, Himalayan Salamander, Red Knobby Newt, Burmese Crocodile Newt Составили: Нуникян Е.Ф. Дата последнего обновления: 29.10.11 1. Биология и по...»

«? [(Pelias darevskii (Vedmederja, Orlov & Tuniyev, 1986)],.00.08 2012 НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ АГАСЯН ЛЕВОН АРАМОВИЧ РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ И ОХРАНА ГАДЮКИ ДАРЕВСКОГО [(Pelia...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2016, том 51, 6, с. 937-945 Микотоксикология кормов, кормовые культуры УДК 636.085.19:636.086.1/.3:632.4(470) doi: 10.15389/agrobiology.2016.6.937rus ПОРАЖЕННОСТЬ ГРУБЫХ КОРМОВ ТОКСИНООБРАЗУЮЩИМИ ГРИБАМИ РОДА Fusarium Е.А. ПИРЯЗЕВА, Г.П. КОНОНЕНКО,...»

«УДК 636.4.085.16 UDC 636.4.085.16 БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ BIOLOGICALLY ACTIVE ДОБАВКИ В КОРМЛЕНИИ ADDITIVES IN THE FEEDING OF РАСТУЩЕГО МОЛОДНЯКА GROWING PIGS СВИНЕЙ М.С. Газзаева, д. с.-х. н., Д.Т. Gazzaeva M.S., Dr. Agr. Sci. Леванов, аспирант Levanov D.T., post-graduate student Горский государственный аграрный Gorsky State Agrarian Universi...»

«Способы терминологической работы при изучении раздела "Живые организмы". Хайруллина Р.Р., Боброва Н.Г. Самарский государственный социально-педагогический университет Самара, Россия Школьный курс биологии представляет собой систему взаимосвязанных понятий, зако...»

«'ООО "Русский букет", Сочи, Россия; 2Кубанский государственный аграрный университет, Краснодар, Россия Мониторинг состояния почв Южно-предгорной зоны Кубани с помощью многоступенчатой системы биоиндикации загрязнения ландшафта Многообразие химических соединений, загрязняющих лан­ дшафты и их комбинированное взаимодей...»

«Аннотация В дипломном проекте рассчитывается конвертор оксида углерода (II) первой ступени, являющийся составной частью установки конверсии природного газа.В проект вошли следующие разделы: • обзор и анализ состояния вопроса;• технологический раздел;• расчетно-конструкторский раздел;• специальный раздел...»

«Министерство образования Российской Федерации Санкт-Петербургская государственная лесотехническая академия им. С. М. Кирова Сыктывкарский лесной институт (филиал) Кафедра экологии и природопользования ОСНО...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Под редакцией: А.А. Никольского, В.В. Рожнова Товарищество научных изданий КМК Москва 2013 Биологическое сигнальное поле млекопитающих. Коллективная монография. Под редакцией А.А. Никольского, В.В. Рожнова. М.: Товарищество научных из...»

«ПРИНЯТО УТВЕРЖДАЮ Педсоветом ГБПОУ ВО "МИК" Директор ГБПОУ ВО "МИК" Протокол от 02.09.2015 года № 1 _Чернышев А.А. Приказ от 03.09.2015 года № 257 ПОЛОЖЕНИЕ О текущем контроле знаний и промежуточной аттестации обучающихся в ГБПОУ ВО "Муромский индустриальный колледж" 1...»

«HT-Line® Maintest-5i Результаты тестирования Тест: Большая Пятерка 2 (ипсати. HUMAN T E CHNOL OGIE S L ABORAT ORY Информация о тестировании Название теста: Большая Пятерка 2 (ипсативная) Дата тестирования: 03.07.2014 (Чт...»

«55 ISSN 0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2016. Вып. 119 Chochlov S.Yu., Melnikov V.A. Modern challenge to the Crimean fruit-growing caused by olive epiphytotics in Italy // Bull. of the State Nikit.Botan. Gard.– 2016. – № 119. – P. 52 – 55. Intensive development of the world trade increases invasive...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ГЕОДЕЗИИ И КАРТОГРАФИИ (МИИГАиК) СБОРНИК ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ И ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ ПО УЧЕБНОМУ КУРСУ "БЕЗОПА...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ УДК 576.895.122.21 (282.247.36) (470.324) КАРПОВЫЕ РЫБЫ КАК ИСТОЧНИК ЗАРАЖЕНИЯ ЧЕЛОВЕКА И ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ ОПИСТОРХОЗОМ В ВОРОНЕЖСКОЙ ОБЛАСТИ Елена Николаевна Ромашова, аспирант кафедры паразитологии и эпизоотологии Воронежский государственный аграрный университет имени импера...»

«Научное электронное периодическое издание ЮФУ "Живые и биокосные системы", № 18, 2016 г. УДК 631.874: 633.49 Семеноводство картофеля в биологическом земледелии Басиев Солтан Сосланбекович, Джиоева Циала Георгиевна, Басиева Алина Солтановна Аннотация: В работе изложены мног...»

«"УТВЕРЖДАЮ" Первый проректор по учебной работе ФГБОУ ВПО "Алтайский государственный университет" Е.С. Аничкин "_" марта 2014 г. ПРОГРАММА вступительного испытания для поступающих на обучение по направлению подготовки научно-педагогических кадров в аспирантуре 06.06.01 – Биологические науки Предмет "Специальная дисциплин...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБУ "Специализированный центр учета в агропромышленном комплексе" ИНФОРМАЦИОННЫЙ ОБЗОР НОВОСТИ АПК: РОССИЯ И МИР итоги, прогнозы, события № 03-12-12 (1222) ФГБУ "СПЕЦЦЕНТУЧЕТ В АПК" МОНИТОРИНГ СМИ ОТ 03.12.2012 Г. СОДЕРЖАНИЕ ВЫП...»

«135 МИР РОССИИ. 1999. N1-2 СОЦИАЛЬНЫЕ РЕАЛЬНОСТИ И СОЦИАЛЬНЫЕ МИРАЖИ ТРАНСНАЦИОНАЛИЗАЦИЯ ГРАЖДАНСКОГО ОБЩЕСТВА: на примере неправительственных экологических организаций в трех постсоветских странах О.Н. Яни...»

«RU 2 399 204 C2 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (51) МПК A01M 21/00 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАН...»

«Министерство здравоохранения РФ Иркутский государственный медицинский университет Кафедра биохимии В.И. Кулинский Лекционные таблицы по биохимии Издание 8 Выпуск 4 Нуклеиновые кислоты Молекулярная биология Молекулярная медицина Иркутск 2006 г. “Лекционные таблицы” предназначены не только для д...»

«ГАЛОФИТНАЯ РАСТИТЕЛЬНОСТЬ САРАТОВСКОГО ЗАВОЛЖЬЯ Лысенко Т. М. Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти, Россия. ltm2000@mail.ru Левобережная часть Саратовской области, или Саратовское Заволжье, в ботанико-географическом отношении находится в трех подзонах Евразиатской степной о...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия "Биология, химия". Том 24 (63). 2011. № 4. С. 224-243. УДК 574.42: 579.61:599.322/.324:614.446 АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ЧУМЫ В СЕВЕРО-ЗАПАДНОМ ПРИЧЕРНОМОРЬЕ (ЧАСТЬ...»









 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.