WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Иркутский государственный медицинский университет» ...»

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

«Иркутский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра фармацевтической и токсикологической химии

Е.А. Илларионова, И.П. Сыроватский

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ИЗ ГРУППЫ ТРАНКВИЛИЗАТОРОВ

Учебное пособие Иркутск ИГМУ УДК 543.2:615.214.22(075.8) ББК 35.66я73 И 44 Учебное пособие обсуждено на методическом совете фармацевтического факультета ИГМУ, рекомендовано к печати и использованию в учебном процессе на кафедре фармацевтической и токсикологической химии, протокол № 2 от 03.11. 2016 г.

Авторы:

Е. А Илларионова – д-р хим. наук, профессор, зав. каф. фармацевтической и токсикологической химии ФГБОУ ВО ИГМУ Минздрава России, И.П. Сыроватский – канд. фарм. наук, доцент каф. фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВО ИГМУ Минздрава России.

Рецензенты:

Заведующая кафедрой «Фармакогнозии и ботаники» Иркутского государственного медицинского университета, доктор фармацевтических наук, доцент В.М. Мирович.

Заведующая кафедрой «Фармацевтической технологии» Иркутского государственного медицинского университета, кандидат фармацевтических наук, доцент В.В. Гордеева.

Илларионова Е.А.

Химико-токсикологический анализ лекарственных средств из группы И 44 транквилизаторов: учебное пособие / Е.А. Илларионова, И.П. Сыроватский; ФГБОУ В О ИГМУ Минздрава России, кафедра фармацевтической и токсикологической химии.

– Иркутск : ИГМУ, 2016. – 44 с.

Учебное пособие охватывает раздел токсикологической химии, касающийся определения транквилизаторов в биологических объектах. В пособии отражены сведения по фармако-токсикокинетическим характеристикам, токсикологии, физико-химическим свойствам наиболее распространенных транквилизаторов и их метаболитов.

Учебное пособие предназначено для студентов обучающихся по специальности высшего профессионального образования «Медицинская биохимия», дисциплина «Основы токсикологической химии».

УДК 543.2:615.214.22(075.8) ББК 35.66я73 © Илларионова Е.А., Сыроватский И.П., 2016 © ФГБОУ ВО ИГМУ Минздрава России, 2016 ОГЛАВЛЕНИЕ Обозначения и сокращения

ВВЕДЕНИЕ

1. Применение бензодиазепинов

2. Физико-химические свойства бензодиазепинов

3. Фармакология

4. Фармакокинетика

5. Токсикология

6. Методы анализа производных бензодиазепинов

7. Предварительные методы

7.1. Иммунохимические методы

7.2. Хроматография в тонком слое сорбента

7.3 УФ спектрофотометрия

8. Подтверждающие методы исследования

8.1 ИК-спектроскопия

8.2 Газовая хроматография (ГХ)

8.3 Газовая хроматография- масс-спектрометрия

8.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

9. Интерпретация результатов анализа

Тестовые задания

Ситуационные задачи

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Обозначения и сокращения Бюро СМЭ – бюро судебно-медицинской экспертизы ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГЖХ – газожидкостная хроматография ЛС – лекарственное средство МС – масс-спектрометрия НД – нормативная документация ТСХ – тонкослойная хроматография ХТА – химико-токсикологический анализ УФ – ультрафиолетовая область спектра рН – водородный показатель ПФИА – поляризационный флюроиммуноанализ ИФА – иммуноферментный анализ ЖЖЭ – жидкость-жидкостная экстракция ТФЭ = твердофазная экстракция ИК – инфракрасная область спектра ПИД – пламенно-ионизационный детектор АФД – азотно-фосфорный детектор ВЭЖХ/МС – сочетание методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии ГХ/МС – сочетание методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии ВВЕДЕНИЕ Транквилизаторы нашли широкое применение в медицинской практике.

Наиболее часто в медицинской практике используются транквилизаторы производные бензодиазепина. Бензодиазепины, по фармакологическому действию относящиеся к транквилизаторам, снотворным, противосудорожным препаратам и центрально-действующим мышечным релаксантам, Они назначаются в широком диапазоне дозировки, начиная с менее 0,1 мг достигая 100 мг и более.

Синтезировано большое число производных бензодиазепина, из них более 50 веществ в настоящее время встречаются на мировом рынке. Главным образом, они выпускаются в капсулах и таблетках, однако, встречаются и в иных формах, таких как растворы для инъекций. Из бензодиазепинов, представленных на мировом рынке, тридцать пять находятся под международным контролем Конвенции психотропных веществ от 1971г.

Наиболее распространенными бензодиазепинами являются нитразепам, диазепам, оксазепам, феназепам, и хлордиазэпоксид и др.

Многие вещества из этой группы, относящиеся к психотропным средствам, используются наркоманами как отдельно, так и в комбинации с другими наркотиками, вызывают привыкание, зависимость и часто являются причиной отравлений.

В пособии представлена информация, касающаяся большой группы транквилизаторов производных бензодиазепина, наиболее часто встречающихся в практике судебно-химического анализа. Такая информация, поможет проведению методологически правильно построенного химикотоксикологического анализа на всех его стадиях, сделать научно обоснованный выбор объекта анализа, его размерности, соответствующей пробоподготовки, выбора предварительных и подтверждающих методов анализа, количественного определения и правильной интерпретации полученных данных.

1. Применение бензодиазепинов Популярность бензодиазепинов объясняется, главным образом, их широким терапевтическим спектром, минимальным побочным действием, особенно, в сравнении с другими снотворными и психотропными препаратами.

По клиническому действию бензодиазепины делятся на следующие группы:

— снотворные и седативные (нитразепам);

— анксиолитики (снимают чувство беспокойства, страха) и малые транквилизаторы (диазепам);

— антидепрессанты (хлордиазэпоксид);

— мышечные релаксанты (диазепам);

— противосудорожные (диазепам);

— внутривенные анестетики.

Внутривенное введение некоторых бензодиазепинов (диазепам) эффективно для снятия приступов эпилепсии.

Типы бензодиазепинов H H O O N N

–  –  –

Нитразепам Диазепам Хлордиазепоксид

2. Физико-химические свойства бензодиазепинов Большинство оснований производных бензодиазепинов белые кристаллические вещества (исключая нитропроизводные), чаще всего растворимы в большинстве органических растворителей, таких как этиловый эфир, этилацетат, хлороформ и метанол, нерастворимы в воде. Липофильность (lg Kp) находится в диапазоне 2,16-2,98. Производные 1,4-бензодиазепина являются слабыми основаниями. Соединения, имеющие в своей структуре амидную группу проявляют амфотерные свойства.

Многие бензодиазепины в кислой среде гидролизуются с образованием соответствующих бензофенонов.

R1

–  –  –

3. Фармакология Все производные бензодиазепина по клиническому действию обладают анксиолитическим, седативным, снотворным, транквилизирующим, противосудорожным, релаксирующим действием в широком фармакодинамическом спектре. Однако преобладание того или другого действия значительно варьирует в зависимости от структуры этих веществ.

Наличие семичленного имино-лактамового кольца важно для действия этой группы веществ на центральную нервную систему, замещение благоприятно лишь в 1, 3, 7 и 2'. Как правило, электроотрицательные заместители в положении 7 и 2' значительно увеличивают активность, доноры электронов снижают активность.

Заместители в положении 7 располагаются в ряду активности следующим образом: NO2 CF3 Br CN C1 N(СНз)2 SOCH3 SC4H9 SCH3 СН3 Н SO2CH3 Ph F Заместители в положении 2' располагаются в ряду активности следующим образом: CI F Br N02 CF3 H ОСН3 СН3 Электроотрицательный фтор является слабым активатором в 7 положении, в противоположность его действию в положении 2'. Заместители в любом другом положении в кольце А и С уменьшают активность. Галоген в 4' — положении приводит почти к полной дезактивации.

В кольце В наиболее выраженный положительный эффект достигается замещением метильной группой в положении 1, большие заместители снижают активность. Замещение алкильными и арильными группами в положении 3 оказывает отрицательное влияние на активность. 3-гидрокси производные, а также 3-карбокси производные и их эфиры активны. 3-карбокси производные очень легко декарбоксилируются и их активность такая же, как активность незамещенных веществ.

Бензодиазепины связываются со специфическими бензодиазепиновыми рецепторами, расположенными, главным образом, в лимбической системе, с помощью медиатора гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) и циклического нуклеотида.

4. Фармакокинетика Метаболизм Большинство бензодиазепинов быстро и полностью поглощаются в желудочнокишечном тракте. Максимальная концентрация в плазме достигается через 1-3 часа после приема внутрь.

Скорость проникновения бензодиазепинов в ткани и выведения из них зависит от скорости кровотока, градиентов концентрации и проницаемости.

Растворимость в липидах играет главную роль, определяющую скорость, с которой бензодиазепины попадают в центральную нервную систему.

Большинство бензодиазепинов интенсивно связываются с белками плазмы крови (в среднем от 80 до 97%).

Для окончательного выведения почти всех бензодиазепинов из организма требуется их превращение в более водорастворимые метаболиты. В этом наиболее важную роль играют микросомные метаболизирующие ферментные системы печени. В связи с тем, что очень мало бензодиазепинов выделяются в неизменном виде, их период полужизни зависит от их пути метаболизма.

Бензодиазепины метаболизируются путем гидроксилирования (алифатического и ароматического), дезалкилирования, реакций восстановления и ацетилирования (фаза I), с последующим конъюгированием перед выделением с глюкуроновой кислотой (фаза II). В большинстве случаев метаболиты в фазе I обладают некоторой биологической активностью, которая может быть больше или меньше по сравнению с нативными веществами, в то время как конъюгаты не обладают значительной активностью. Некоторые бензодиазепины могут рассматриваться, как пролекарства.

–  –  –

Бензодиазепины часто вызывают привыкание и пристрастие.

Ощутимое желание облегчить беспокойство, подавленность, вызвать эйфорию и сон приводит к привыканию, пристрастию и зависимости от бензодиазепинов.

Наблюдается как психологическая, так и физическая зависимость.

Психологическая зависимость проявляется в нервозном поведении, которое трудно отличить от состояния курильщиков сигарет. Когда последствия становятся серьезнее, появляется толерантность и физическая зависимость.

Повторное применение бензодиазепинов приводит к развитию толерантности, т. е. к увеличению необходимых доз, в несколько раз больших терапевтических.

Вследствие этого концентрация в крови будет значительно превышать терапевтическую концентрацию, указанную в литературе. Физическая зависимость от бензодиазепинов может привести к синдрому абстиненции, включая гиперактивность, беспокойство, делирий, галлюцинации и мышечные судороги. Более длительно действующие бензодиазепины при применении часто вызывают более выраженный синдром абстиненции, продолжающийся в течение нескольких дней после прекращения приема препарата.

Побочное действие. Клинические признаки передозировок бензодиазепинов При максимальной концентрации в плазме бензодиазепины могут вызывать различную степень апатии, увеличение времени реакции, нарушение моторной координации, атаксию, нарушение умственной и психомоторной функции беспорядок мыслей, спутанность сознания, сухость и горечь во рту. К другим побочным эффектам бензодиазепинов относятся слабость, головная боль, затуманенное зрение, головокружение, тошнота и рвота, эпигастральное расстройство и диарея, суставные боли, боли в области грудной клетки, у некоторых может развиться недержание.

Передозировка бензодиазепинов вызывает сонливость, атаксию (расстройство координации движения), мышечную слабость и глубокую кому.

После приема внутрь и внутривенного введения больших доз бензодиазепинов часто наблюдается амнезия.

Применение бензодиазепинов с другими веществами, такими как алкоголь и наркотики, усиливает токсический эффект. Одновременное применение бензодиазепинов и алкоголя так же, как прием повышенных доз бензодиазепинов, вызывает значительные изменения в поведении человека, вызывая агрессию, расстройство психических процессов и растормаживание, как это наблюдается у хронических алкоголиков.

Для лечения передозировки бензодиазепинов вводят специфический антагонист бензодиазепинов — флюмазенил. Внутривенная доза флюмазенила до 1 мг снимает кому и депрессию ЦНС. Флюмазенил принимают также и внутрь.

Ниже представлена сравнительная токсичность бензодиазепинов, эквивалентная 10 мг диазепама.

Оксазепам 40 мг Хлордиазепоксид 20 мг Нитразепам 5 мг Феназепам 10 мг Бензодиазепины часто являются причиной отравлений и встречаются в судебно-медицинской практике.

Взаимодействие бензодиазепинов с другими центрально действующими веществами, такими как алкоголь, опиаты, трициклические антидепрессанты, фенотиазины или барбитураты могут привести в смертельной интоксикации при более низких концентрациях. Бензодиазепины могут оказывать влияние на познавательную и психомоторную деятельность и таким образом ухудшать внимание водителей. Это неблагоприятное влияние может усиливаться алкоголем.

Попадают в центральную нервную систему. Большинство бензодиазепинов интенсивно связываются с белками плазмы (в среднем от 80 до 97%).

6. Методы анализа производных бензодиазепинов Следующие разделы касаются различных аспектов методов анализа бензодиазепинов в биологических пробах, что позволит сделать правильный выбор в зависимости от поставленных задач и инструментальных возможностей лаборатории.

Как было указано выше, бензодиазепины метаболизируются путем гидроксилирования, дезалкилирования и реакций восстановления с последующим образованием глюкуронидов. При выборе метода анализа на тот или иной бензодиазепин необходимо руководствоваться информацией о путях метаболизма применительно к выбранному для анализа объекту (биологической пробе). Метод анализа зависит не только от типа пробы и цели исследования (обнаружение нативных веществ и метаболитов или продуктов гидролиза), но и от поставленных задач, а именно качественное обнаружение или количественное определение, предварительный или подтверждающий метод анализа, инструментальных возможностей лаборатории (ТСХ, ГХ, ГХ/МС, ВЭЖХ) и количества анализируемого вещества, которое может быть получено в конечной стадии анализа. Это и определяет размер пробы, требующейся для анализа. Химические свойства бензодиазепина определяют правильный подход к анализу. Структура бензодиазепина определяет метод извлечения, какому детектору в хроматографе надо отдать предпочтение для повышения чувствительности, снижения влияния соэкстрактивных веществ и повышения специфичности.

Скрининговые методы, даже если они высоко селективны и чувствительны, должны быть подтверждены независимыми химическими и инструментальными методами для обеспечения надежности результата. И главное, любой метод, который строится на основании изложенных ниже рекомендаций, должен быть отработан и проверен в лаборатории на стандартных веществах и тех же самых биологических матрицах, что и исследуемые пробы, для решения пригодности метода для поставленных задач.

Необходимо провести определение пределов обнаружения, т.е.

наименьшего количества вещества, при котором лаборатория, используя данный метод, может надежно обнаружить вещество, а также уровня, при котором результат исследования пробы может считаться положительным или отрицательным.

Кроме того, в лаборатории должен быть определен предел определения, т.е. наименьшая концентрация, при которой исследуемое вещество определяется при заданной степени вероятности.

Существуют два основных подхода для экспериментального определения предела обнаружения и предела определения; статистический и эмпирический.

Для статистического решения готовятся позитивные пробы на той же биологической матрице, что и исследуемая проба, и анализируются множество раз тем же методом (например, п=10). Определяется средний результат и стандартное отклонение (SD) от среднего. Согласно этому подходу принято, что статистический предел обнаружения равен среднему плюс трехкратное SD (99% вероятность), а статистический предел определения равен среднему результату плюс 10 кратное стандартное отклонение. Кроме того, предел обнаружения должен иметь отношение сигнал/шум 3:1, а предел определения сигнал/шум 10:1.

Более широко принят эмпирический подход, который включает использование серийных разведений позитивных проб соответствующим разбавителем (например, исследуемой биологической матрицей). Разведения готовятся и исследуются до концентрации, при которой результат впервые не отвечает критериям метода.

Другим непременным требованием в токсикологическом анализе является использование отрицательных и положительных контролей. При этом контрольный материал должен готовиться на той же матрице, что и проба, которая будет исследоваться. При использовании единичных измерений, по крайней мере, одна положительная контрольная проба должна быть проанализирована в аналогичных условиях и концентрация исследуемого вещества в ней должна находится вблизи уровня, при котором результат исследования пробы считается положительным, (по некоторым требованиям, на 25% выше и ниже концентрации, при которой проба считается положительной). При этом калибровка и контрольная проба должна анализироваться одновременно тем же методом. Исследованная за несколько дней до или после анализа неизвестного, во внимание не принимается.

Отрицательная проба исследуется по двум причинам:

1. Для исключения влияния эндогенных веществ при использовании даже высоко специфичного аналитического метода, особенно при низком содержании вещества;

2. Для исключения попадания исследуемого вещества из предыдущей пробы, которая анализировалась на данном приборе.

Вещества, на которые проводятся исследование биологических объектов Часто требуется обнаружить в крови или в тканях внутренних органов нативные бензодиазепины или дезалкилированные метаболиты. Эти вещества экстрагируются, как будет описано ниже, различными растворителями.

Большинство бензодиазепинов в дальнейшем метаболизируются до гидрокси — бензодиазепинов, например, до оксазепама. Эти гидрокси метаболиты выделяются с мочой почти полностью в виде глюкуронидов, растворимых в воде. Глюкурониды должны гидролизоваться до получения свободной формы метаболитов для эффективной экстракции органическими растворителями и для возможности связывания с антителом в иммуноферментном анализе.

Рекомендуется для этих целей энзиматический гидролиз, т.к. в сильно кислой или щелочной среде может произойти расщепление структуры самих бензодиазепинов.

Пример ферментативного гидролиза глюкуронидов.

Материалы и реагенты

1. Буфер — 2М раствор ацетата натрия, рН 4,5

2.Helix pomatia -glucuronidase (100,000 ед/мл) Метод

1. Добавить 50 мкл 2М буфера ацетата натрия рН 4.5 к 1 мл мочи.

2. Добавить 50 мкл Helix pomatia -glucuronidase (100,000 ед/мл).

3. Нагреть смесь при 50° С в течение 2 часов.

Примечание: Основной гидролиз проходит в течение первых 20 — 30 мин, но обычно оптимально требуется 2 часа.

Следует иметь в виду, что ферментативная активность -глюкуронидазы не одинакова в разных партиях реагентов. Для исключения возможных осложнений требуется проводить контрольные исследования полученных реактивов.

Пример кислотного гидролиза бензодиазепинов В 500 мл колбу Эрленмейера поместить 100 мл мочи и добавить 50 мл концентрированной соляной кислоты (25%). (В зависимости от объема пробы концентрированную соляную кислоту добавляют до общего содержания кислоты в пробе 10—12%). Нагревать 30 мин в водяной бане с обратным холодильником. По окончании промыть конденсат в холодильнике несколькими мл конц. соляной кислоты.

Нейтрализация и экстракция бензофенонов После гидролиза охладить раствор до комнатной температуры и затем под тягой и в перчатках при последующем охлаждении добавить 8М раствор гидроксида натрия до рН 8-9 по универсальной индикаторной бумажке (приблизительно около 5 мл). Экстрагировать производные аминобензофенона 200 мл диэтилового эфира. Для увеличения выхода экстракцию можно повторить 100 мл диэтилового эфира при рН 11. Сконцентрировать объединенные экстракты до объема 3 мл в роторном испарителе, перенести этот концентрат в стеклянную центрифужную пробирку и осторожно выпарить досуха (при 30—40°С). Охладить остаток до 4°С. Для анализа растворить остаток в 0,1 мл метанола.

–  –  –

Жидкость-жидкостная экстракция

1. 1 мл пробы поместить в стеклянную пробирку емкостью 15 мл. Добавить соответствующий внутренний стандарт.

2. 1 мл 2М Трис- буфера, рН 9, и 8 мл и — бутилхлорида.

3. Смесь осторожно вращать в течение 15 мин, затем центрифугировать.

4. Верхний слой н-бутилхлорида перенести в чистую пробирку и выпарить досуха.

5. Остаток растворить в растворителе, например, в метаноле для дальнейшего исследования.

Твердо-фазная экстракция мочи с помощью колонок со смешанными фазами Материалы и реагенты

1. Колонки Clean Screan DAU (United Chemical Technologies) 2. 0,1M фосфатный буфер рН 6,0.

1. Гидролизовать 5 мл мочи — глюкуронидазой.

2. Добавить соответствующий внутренний стандарт.

3. Кондиционировать колонку последовательно 3 мл метанола, 3 мл воды и 1 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,0.

4. Пропустить пробу мочи через влажный сорбент колонки со скоростью 1—2 мл/мин.

5. Промыть колонку 2 мл воды, затем 2 мл 20% раствора ацетонитрила в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,0.

6. Просушить колонку, создавая вакуум насосом около 5 мин.

7. Промыть колонку 2 мл гексана.

8. Элюировать вещества 3 мл этилацетата.

9. Выпарить элюат досуха и остаток растворить в 100 мкл этилацетата.

Примечание: Выход бензодиазепинов в пределах 85 — 94%.

Твердофазная экстракция бензодиазепинов из крови при рН 9,0 Материалы

1. Clean Up С is колонки, 100 мг (Worldwide Monitoring Corporation).

2. Боратный буфер, рН 9.

В чистую маркированную пробирку 16x100 мм поместить пипеткой 2 мл крови (от живого лица или от трупа) и соответствующий внутренний стандарт.

Добавить 1 мл ацетона, смешать и центрифугировать.

1. Выпарить надосадочную жидкость досуха и остаток растворить в 2 мл боратного буфера, рН 9.

2. Кондиционировать колонку Clean Up C is последовательно 2 мл метанола, 2 мл воды и 1 мл боратного буфера, рН 9.

3. Пропустить предварительно подготовленную пробу через влажную колонку со скоростью 1 мл/мин.

4. Промыть колонку последовательно 1 мл воды и 1 мл 15% раствора метанола в воде.

5. Просушить колонку центрифугированием, затем элюировать бензодиазепины 1 мл метанола.

6. Выпарить элюат досуха при 35-43°С и остаток растворить в 20 мкл метанола.

Примечание: Выход бензодиазепинов находится в пределах 75 — 94%.

Твердо-фазная экстракция бензодиазепинов в моче при рН 9,3 Материалы

1. 7 мл 0,1М буфер бората натрия. рН 9.3.

2. Несколько капель конц. раствора гидроксида аммония или гидроксида натрия

3. Элюент: дихлорметан/изопропанол/конц. аммиак (78/20/2).

4. 200 мг Clean Screen экстракционные колонки.

Пробоподготовка

1. В чистые маркированные пробирки 16x100 мм поместить 5 мл мочи.

2. Добавить соответствующий внутренний стандарт(ы).

Примечание: Внутренние стандарты и их концентрация выбирается на основании концентрации и наименования анализируемого бензодиазепина, определяемого в пробе.

3. Добавить 2 мл рабочего раствора ацетата натрия.

4. Встряхнуть пробы на смесителе.

5. Выдержать 3 часа при 58 - 65 °С.

6. Установить рН 8,5+0,5 несколькими каплями концентрированного гидроксида аммония.

7. Центрифугировать при 2500 об/мин не менее 15 мин.

Экстракция:

1. Кондиционировать колонку последовательно 3 мл метанола, 3 мл деионизированной воды, 1 мл буфера бората натрия, рН 9,3.

2. Перенести пробу в колонку (для снижения вязкости пробы можно добавить в резервуар дополнительную порцию буфера).

3. Промыть колонку 3 мл 10% (об/об) метанола в деионизированной воде.

4. Просушить колонку минимально в течение 5 мин при максимальном вакууме.

5. Элюировать бензодиазепины 3мл элюента дихлорметан/изопропанол/ аммиак (78/20/2).

6.Выпарить элюат досуха в токе азота при 35 — 43 °С.

Примечание: Из-за различий химических свойств бензодиазепинов, как класса, выход некоторых бензодиазепинов не оптимален. Например, если из обстоятельств дела известно, что в пробе могут находится оксазепам, рекомендуется использовать альтернативный метод экстракции/элюирования.

7. Предварительные методы

7.1. Иммунохимические методы Различные ИХМ (радиоиммуноанализ, ПФИА, ИФА, иммунохроматографические) используются при скрининге биообразцов.

Положительные результаты позволяют сделать предположение о наличии в тестируемом объект вещества из группы бензодиазепинов, но без внутригрупповой дифференцировки. Данные, полученные ИХМ, обязательно подтверждают другими чувствительными и специфичными методами, интерпретируют, сопоставляя с клиническими и лабораторными данными.

Наличие в моче аналита и/или его метаболитов свидетельствует только о предшествующем приеме вещества, при этом его концентрация (и/или метаболитов) не коррелирует с концентрацией периферической крови или тяжестью состояния.

Основной недостаток ИХМ высокая перекрестная реактивность веществ со сходной химической структурой (до 80%), но тем не менее в случаях злоупотреблений или острого отравления препаратами этой группы ИХМ является достаточно надежным и быстрым методом, используемым в химикотоксикологических лабораториях при установлении принадлежности аналита не только к группе бензодиазепинов, но и к различным подгруппам (например, триазоло- и имидазолопроизводные).

7.2. Хроматография в тонком слое сорбента Хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ) широко используется для скрининга бензодиазепинов и их метаболитов.

ТСХ-скрининг позволяет проводить предварительную идентификацию большого числа веществ в достаточно короткие сроки и сравнительные исследования различных образцов. Бензодиазепины образуют группу разнообразных химических веществ, однако использование в сочетании 3 указанных ниже систем ТСХ обеспечивает хорошее разделение. Сорбент — активированный силикагель G на высушенных стеклянных пластинах, покрытие (толщина 0,25 мм) содержит флюоресцентную добавку, которая флюоресцирует при длине волны 254 нм. Используют следующие системы.

Система А: хлороформ—ацетон (40:20); система В: хлороформ- метанол (90:

10), система С: циклогексан—толуол—диэтиламин (75:15:10). Детекция при последовательном выполнении: УФ-излучение при 254 нм; 2М серной кислоты, нагревание до 80оС, УФ-излучение при 366 нм; реагент подкисленный йодплатинат калия (пятна пурпурной окраски). Значения Rf производных бензодиазепина в проявляющих системах А, В, С приведены в таблице.

–  –  –

Возможно также обнаружения пятен на хроматограммах, включающим гидролиз бензодиазепинов до соответствующих производных первичных аминобензофенонов, с последующим диазотированием по реакции Браттона — Маршала. Образованные при этом азокрасители имеют четко выраженное фиолетовое окрашивание. Метод рекомендован для мочи, т.к. сильный кислый гидролиз не подходит для крови и сыворотки. В некоторых работах эта процедура включает этап фотолитического дезалкилирования после кислого гидролиза. Однако, как правило, достаточно дезалкилметаболитов, чтобы опустить этот этап дезалкилирования, методика является чувствительной.

Метод не годится для метаболитов бензодиазепина, которые не могут гидролизоваться до первичных аминобензофенонов для реакции Браттона — Маршалла. Это относится к триазоло-бензодиазепинам, как алпразолам.

Эстазолам, триазолам, а также к нитро-бензодиазепинам, как нитразепам, клоназепам.

–  –  –

8. Подтверждающие методы исследования

8.1 ИК-спектроскопия Легкоинтерпритируемые ИК-спектры получаются при работе с растворами в четыреххлористом углеводороде. Однако низкая растворимость в нем многих бензодиазепинов не всегда позволяет получать такие спектры.

Спектры, получаемые из кристаллических образцов бензодиазепинов, как правило, сложнее вследствие межмолекулярных взаимодействий. В них достоверное отнесение можно сделать только для некоторых характеристических полос.

–  –  –

8.2 Газовая хроматография (ГХ) Образование производных (дериватизация) Химическая структура многих анализируемых веществ, особенно полярность, если присутствуют гидрокси— и амино— группы, может ограничить эффективность газовой хроматографии. Поэтому используется техника дериватизации. Описаны силильные, ацильные и алкильные производные. Высокие концентрации бензодиазепинов (при введении в хроматограф 1—2 мкл) могут быть определены без дериватизации.

Силильные производные имеют преимущества в масс — спектрометрии в связи с тем, что дают стабильные ионы с высокими молекулярными массами.

Однако, силилированные экстракты из биологического материала имеют тенденцию быть грязными и поэтому не годятся для азотно — фосфорного детектора (NPD). Силилирование не усиливает отклик электронно — захватного детектора (ECD).

Ацилирование и алкилирование гидрокси— и амино— производных осуществляют пропионил хлоридом и пропилиодидом, соответственно.

Ацилирование/алкилирование имеет преимущество в связи с тем, что производные могут в дальнейшем перед анализом подвергаться процедурам очистки.

Насадочные колонки В газовой хроматографии бензодиазепинов на набивных колонках имеется большой выбор стационарных фаз. Годятся любые умеренные неполярые фазы, такие как диметилсиликон (OV—1, OV—30 ) или 50% фенил 50% метилсиликон. Длина и внутренний диаметр, хотя и влияют на величины удерживание веществ, могут отличаться от рекомендованных при условии хорошо подобранных аналитиком хроматографических условий и контроле специфичности, воспроизводимости и других параметров метода.

Газовая хроматография на насадочных колонках имеет ограниченную чувствительность и, поэтому, подходит только для анализа высоких концентраций в пробах гидролизованной мочи.

Капиллярные колонки Подобно газовой хроматографии на насадочной колонке выбор капиллярных колонок в отношении стационарных фаз, толщины пленки, размера и типа колонки велик. Каждая колонка должна быть проверена, подходит ли она для данного анализа и метод должен быть проверен в отношении специфичности, воспроизводимости и других показателей.

Большинство диметилсиликоновых и недериватизированных экстрактов или 5% фенилметилсиликоновых колонок могут быть использованы для анализа дериватизированных.

Детекторы Для анализа бензодиазепинов методом газо—жидкостной хроматографии рекомендуются электронно—захватный детектор (ECD) и азотно — фосфорный (NPD) детектор, (часто именуемый азотно — селективным детектором). Пламенно — ионизационный детектор (FID), как правило, не достаточно чувствителен для анализа бензодиазепинов. Масс-селективные детекторы, такие как масс-спектрометры или ионные ловушки часто применяются в комбинации с капиллярной газовой хроматографией.

–  –  –

8.3 Газовая хроматография- масс-спектрометрия Хромато — масс — спектрометрия является высоко специфичным подтверждающим методом для анализа бензодиазепинов.

Для идентификации бензодиазепинов ГХ/МС необходимо снимать спектры полного ионного тока (в режиме полного сканирования).

Идентификация проводится на основании сравнения времени удерживания и не менее трех основных ионов с стандартными веществами,

Оборудование:

Газовый хроматограф/Масс - спектрометр (Hewlett Packard) Масс селективный детектор или аналогичное оборудование), оснащенное капиллярной колонкой HP-1 (25-30 м).

Стандарты и внутренние стандарты:

1. Смесь бензодиазепинов — Приготовить, например, спиртовый раствор 2мкг/100мкл диазепама, нордиазепама, темазепама, флюразепама, оксазепама, хлордиазепоксида Примечание: В тестовую смесь можно добавить и другие бензодиазепины, извлекаемые в этих условиях, если предполагается нахождение их в исследуемой пробе.

2. Внутренний стандарт – например, 25 мкл раствора, содержащего 5 мкг/100 мкл мепивакаина., извлекаемые в этих условиях с учетом их величины рКа и растворимости.

Экстракция:

1. Промаркировать пробирки с завинчивающимися крышками для отрицательной крови, стандартов, (или калибраторов), контроля и исследуемых проб.

2. Добавить в каждую пробирку по 0,5 мл деионизированной воды.

3. В соответствующие пробирки добавить 25, 50, 100, 200 и 400 мкл стандартной смеси бензодиазепинов. (концентрация стандартов в крови составит: (А) 10 мкг/ 100 мл диазепама, нордиазепама, оксазепама и хлордиазепоксида; (В) 20 мкг/100 мл диазепама, нордиазепама, оксазепама и хлордиазепоксида; (С) 40 мкг/100 мл диазепама, нордиазепама, оксазепама и хлордиазепоксида; 5 мкг/100 мл альпразолама и триазолама; (D) 80 мкг/100 мл диазепама, нордиазепама, оксазепама и хлордиазепоксида; (Е) 160 мкг/100 мл диазепама, нордиазепама, оксазепама и хлордиазепоксида.

Примечание: Концентрация стандартов может быть изменена в соответствии с определяемой концентрацией в конкретном случае.)

4. Добавить 25 мкл раствора внутреннего стандарта (мепивакаина) 5мкг на 100 мкл.

5. Сильно встряхнуть пробирки с помощью вортекса-смесителя и затем добавить в каждую пробирку по 5 мл крови (отрицательной или исследуемой) и встряхнуть их еще раз.

Примечание: Этим методом можно исследовать и пробы мочи.

6. Добавить в каждую пробирку на кончике ложки NaCl и по 1 мл буфера хлорида аммония рН 9 и 100 мкл концентрированного аммиака. Встряхнуть каждую пробирку.

7. В каждую пробирку добавить по 10 мл н-бутилхлорида, плотно закрыть крышки и экстрагировать в течение 30 минут на аппарате для встряхивания жидкости в сосудах.

8. Центрифугировать пробирки в течение 10 мин.

9. Перенести верхний органический слой в чистые пробирки.

10. В пробирки добавить стеклянные бусинки и деревянную палочку и выпарить н-бутилхлорид досуха.

11. К остаткам добавить по 1 мл ацетонитрила и встряхнуть. Затем по 3 мл гексана и встряхивать точно 30 секунд.

12. Центрифугировать и осторожно отсосать верхний гексановыи слой на выброс водоструйным насосом.

13. Выпарить ацетонитрил досуха.

14. Добавить в каждую пробирку по 3 мл этилового эфира. Встряхнуть.

Добавить по 3 мл 0,1М раствора КОН. Встряхнуть. Центрифугировать и перенести органический слой в чистые пробирки и выпарить досуха.

Полученный сухой остаток использовать для исследования.

–  –  –

8.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) ВЭЖХ применяется для количественного определения бензодиазепинов. Значение этого метода для скрининга противоречиво изза воспроизводимости времен удерживания от колонки к колонке и зависит от ряда факторов. Для анализа бензодиазепинов в биологических пробах используются обращено — фазные колонки.

Подвижные фазы — кислые, смесь фосфатного буфера и ацетонитрила и/или метанола. Важно контролировать рН подвижной фазы, т.к. небольшая разница значительно влияет на результаты хроматографии. Для сложных смесей бензодиазепинов или при анализе неизвестного, необходим градиентный анализ или комбинация изократических систем. Большинство бензодиазепинов определяют при 230 нм, нитробензодиазепины при 240 нм. Для лучшей идентификации требуется диодно - матричное детектирование.

Кровь Ниже описан метод, который включает жидкость/жидкостную экстракцию проб крови. Он рекомендован для ВЭЖХ анализа бензодиазепинов, введенных при более высоких дозах, таких как оксазепам, диазепам и нордазепам. ВЭЖХ обычно не годится для бензодиазепинов, которые принимают в меньших дозах, таких как триазолам, альпразолам, лоразепам и лорметазепам.

ВЭЖХ МЕТОД ДЛЯ КРОВИ

Хроматографические условия Колонки: Кварцевая, на фенилсиликоне (Waters Nova —Рас Phenyl или эквивалент), размер частиц - 4 мкм, 150 мм х 3,9 мм (вн. Диаметр).

Подвижная фаза: Ацетонитрил — 40 mМ фосфатного буфера, рН 3,75 (28:72 об/об) Скорость тока: 0,8 мл/мин Детектор: 230 - 250 нм в зависимости от анализируемых веществ Пробоподготовка 1. 0,5 мл пробы перенести в стеклянную пробирку для экстракции.

2. Добавить 0,5 мл 0.2 М карбонатного буфера, рН 11.5

3. Смесь экстрагировать 6 мл н-бутилхлорида.

4. Слой н-бутилхлорида (верхний слой) перенести в чистую пробирку для экстракции и выпарить досуха.

5.Остаток растворить в 200 мкл подвижной фазы.

Моча Как указано ранее, вещества, которые приходится искать в крови или плазме, отличаются от веществ, находящихся в моче. Перед ВЭЖХ анализом бензодиазепинов требуется ферментативный гидролиз. Условия ВЭЖХ анализа бензодиазепинов в моче подобны условиям анализа крови и плазмы, но оптимизированы для анализа полярных метаболитов.

ВЭЖХ МЕТОД ДЛЯ МОЧИ

Хроматографические условия Колонка: LiChrospher 100 RP8 или эквивалент, размер частиц - 5 мкм, 250 мм х 4 мм (вн. диаметр), с предколонкой.

Подвижная фаза:

а) градиентный метод:

0,01 М фосфатный буфер, рН 3,5, содержащий 0,02 М метансульфоновой кислоты – ацетонитрил (70:30, об/об) -1 мин. затем изменение до 60:40 обмин. Окончательное соотношение - 11 мин.

б) изократический метод 0,01 М фосфатный буфер, рН 3,5, содержащий 0,02 М метансульфоновой кислоты (methanesulfonic acid) — ацетонитрил (55:45, об/об) Скорость тока: 1 мл/мин Детектор: 234 нм Пробоподготовка Пробы мочи гидролизуют перед экстракцией в соответствии с описанием приведенным ранее. Экстракция проводится, как описано ранее, особенно рекомендуется твердофазная экстракция.

ВЭЖХ МЕТОД ДЛЯ МОЧИ

Хроматографические условия Колонки: LiChrospher 100 RP8 или эквивалент, размер частиц - 5 мкм, 125 мм х 4 мм (вн. диаметр), с предколонкой.

Подвижная фаза: 0,01 М фосфатный буфер, рН5.6 — ацетонитрил(60:40, об/об) Скорость тока: 1.6 мл/мин Детектор: 254 нм Пробоподготовка Пробы мочи гидролизуют перед экстракцией в соответствии с описанием приведенным ранее. Экстракция проводится, как описано ранее, особенно рекомендуется твердофазная экстракция.

Примечание: Предел обнаружения 5 нг в 1 мл мочи.

9. Интерпретация результатов анализа Моча Концентрация бензодиазепинов и их метаболитов в моче не может быть связана с принятой дозой вещества, так как зависит от объема выделяемой жидкости, креатининового клиренса (функции почек), времени, прошедшего после приема и индивидуальных особенностей метаболизма отдельных лиц.

По концентрации бензодиазепинов в моче едва ли можно судить об отравлении бензодиазепинами. В моче бензодиазепины и их метаболиты находятся почти полностью, как глюкурониды, плохо экстрагируемые растворителями.

Оксазепам является наиболее часто встречающимся метаболитом многих бензодиазепинов. Поэтому, если не обнаружены специфические метаболиты, то невозможно установить, какой бензодиазепин был принят. Триазоло— и нитро — бензодиазепины образуют специфические метаболиты.

В этом контексте было бы полезно установить нативное вещество в крови и тканях внутренних органов.

Кровь, сыворотка и плазма Кровь (или сыворотка или плазма) являются наиболее важными объектами для оценки степени интоксикации. Однако, при интерпретации результатов следует учитывать толерантность, наличие сопутствующих заболеваний, одновременный прием других средств, подавляющих ЦНС (алкоголь, наркотики) Так как бензодиазепины чаще всего в крови находятся в очень низкой концентрации, кровь не всегда является оптимальным объектом для обнаружения бензодиазепинов. Предпочтение отдается моче для многочисленных иммунологических и хроматографических методов скрининга.

Период времени, в течение которого можно обнаружить в биологических объектах бензодиазепины, зависит от ряда факторов, включая дозу препарата, различия в метаболизме и выведении различных бензодиазепинов, хроническое или острое введение, одновременный прием других веществ, которые могут ослаблять или усиливать метаболизм и, наконец, зависит от применяемой аналитической методологии. Как правило, бензодиазепины могут быть обнаружены в моче приблизительно в течение периода от 24 — 48 часов после приема бензодиазепинов короткого действия до семи дней и более для препаратов среднего и длительного действия.

–  –  –

1. ПРОИЗВОДНЫЕ 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА ЯВЛЯЮТСЯ

1) окрашенными веществами, хорошо растворимыми в воде

2) окрашенными веществами, нерастворимыми в воде

3) неокрашенными веществами, хорошо растворимыми в воде

4) неокрашенными веществами, не растворимыми в воде

2. ДЛЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА ХАРАКТЕРНА РЕАКЦИЯ

ГИДРОЛИЗА, КОТОРАЯ ПРОТЕКАЕТ С РАЗРЫВОМ

1) ароматического кольца

2) гетероциклического кольца Укажите название

3. ПРОИЗВОДНЫЕ 1,4-БЕНЗДИАЗЕПИНА НАКАПЛИВАЮТСЯ В ТКАНЯХ

БОГАТЫХ (______________).

Укажите название

4. ПРОИЗВОДНЫЕ 1,4-БЕНЗДИАЗЕПИНА И ПРОДУКТЫ ИХ МЕТАБОЛИЗМА В ОСНОВНОМ ВЫВОДЯТСЯ (___________).

5. АМИНОБЕНЗОФЕНОНЫ ЯВЛЯЮТСЯ ПРОДУКТАМИ

1) метаболизма производных 1,4-бензодиазепинов

2) кислотного гидролиза производных 1,4-бензодиазепинов

6. ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МЕТОДА ВЭЖХ, В АНАЛИЗЕ ПРОИЗВОДНЫХ

БЕНЗОДИАЗЕПИНА, В КАЧЕСТВЕ ДЕТЕКТОРА МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ

УФ-детектор

1) да

2) нет

–  –  –

9. МАКСИМАЛЬНОЕ ВСАСЫВАНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4БЕНЗОДИАЗЕПИНА ПРОИСХОДИТ

1) в полости рта

2) в желудке

3) в тонком кишечнике

4) в толстом кишечнике Укажите название

10. ПРИ ИЗМЕНЕНИИ рН РАСТВОРА У ПРОИЗВОДНЫХ 1,4БЕНЗОДИАЗЕПИНА ПРОИСХОДИТ ИЗМЕНЕНИЕ ХАРАКТЕРА

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЙ КРИВОЙ Т.К. ДАННЫЕ ВЕЩЕСТВА

ПРОЯВЛЯЮТ (_____________) СВОЙСТВА

11. ПОДТВЕРЖДАЮЩИМИ МЕТОДАМИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ

1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА ЯВЛЯЮТСЯ

1) хромогенные реакции

2) ИХМ

3) ВЭЖХ

4) ТСХ

12. ДЛЯ ИЗОЛИРОВАНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА ИЗ

БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ИСПОЛЬЗУЮТ

1) экстракцию подкисленной водой

2) экстракцию органическим растворителем при рН7

3) экстракцию подщелоченной водой

4) экстракцию органическим растворителем при рН7

13. ПРОИЗВОДНЫЕ 1,4-БЕНЗДИАЗЕПИНА ПО ХИМИЧЕСКОЙ

КЛАССИФИКАЦИИ МОЖНО ОТНЕСТИ

1) классу амидов гетероциклического ряда

2) классу кетонов гетероциклического ряда

3) классу альдегидов гетероциклического ряда

4) классу спиртов гетероциклического ряда

14. ДЛЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-БЕНЗДИАЗЕПИНА ХАРАКТЕРНА

1) кето-енольная таутомерия

2) лактим-лактамная таутомерия

3) имидо-имидольная таутомерия Выберите несколько правильных ответов

15. СИМПТОМЫ ОТРАВЛЕНИЯ ТРАНКВИЛИЗАТОРАМИ

1) поверхностная кома

2) понижение артериального давления

3) отсутствие реакции на свет

4) повышение температуры тела

16. УКАЖИТЕ БЕНЗОДИАЗЕПИНЫ ОБЛАДАЮЩИМИ АМФОТЕРНЫМИ

СВОЙСТВАМИ

1) диазепам

2) нитразепам

3) оксазепам

4) феназепам

5) хлордиазепоксид

17. ПРОИЗВОДНЫЕ 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА ЯВЛЯЮТСЯ

1) сильными кислотами

2) слабыми основаниями

3) амфолитами

4) сильными основаниями

18. ПРИ ПРОВЕДЕНИИ СКРИНИНГА ПРОИЗВОДНЫЕ 1,4БЕНЗОДИАЗЕПИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТСХ, ОБНАРУЖЕНИЕ

ВЕЩЕСТВ НА ПЛАСТИНКЕ ПРОВОДИТСЯ

1) в УФ-свете

2) по реакции йодплатинатом калия

3) по реакции Браттона-Маршалла

4) по реакции с реактивом Фелинга

5) по реакции с FNP-реактивом

19. ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4БЕНЗОДИАЗЕПИНА ИСПОЛЬЗУЮТ

1) ИХА (имуннохимический анализ)

2) ТСХ

3) ВЭЖХ

4) ГХ/МС

20. ПУТИ ПОСТУПЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА В ОРГАНИЗМ

1) суббукально

2) перорально

3) парентерально

4) сублингвально

21. В КАЧЕСТВЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫХ МЕТОДОВ ХТА

ТРАНКВИЛИЗАТОРОВ ИСПОЛЬЗУЮТ

1) ИК-спектроскопию

2) ГХ/МС

3) цветные реакции

4) ТСХ

22. БИОТРАНФОРМАЦИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА СВЯЗАНА

1) восстановление ароматического кольца

2) деалкилирование N-алкильных производных

3) восстановления NO2 до NH2

4) гидроксилирования при С3 атоме углерода

23.УСТАНОВИТЕ СООТВЕТСТВИЕ МЕЖДУ НАИМЕНОВАНИЕМ

ПРОИЗВОДНОГО 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА И ПРОДУКТОМ РЕАКЦИИ ЕГО

ПРЕВРАЩЕНИЯ

наименование продукт реакции

1) оксазепам а) 2-амино-5-нитробензофенон

2) нитразепам б) 2-амино-5-хлоробензофенон

3) феназепам в) 2-метиламино-5-хлоробензофенон г) 2-амино-5-хлоро-2/-бромобензофенон

4) диазепам д) 2-амино-5-хлоро-2/-флуоробензофенон е) 2-метиламино-5-хлоро-2/-бромобензофенон

–  –  –

Дополнительная

1. Альберт А. Избирательная токсичность / Пер. с англ. - М.: Медицина, Т.1,2., 1989. - 400 с.

2. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия : учебное пособие : / В.Г. Беликов.

– М. : МЕДпресс-информ, 2009. – 616 с.

3. Лужников Е.А., Костомарова Л.Г. Острые отравления: руководство. - М.:

Медицина, 2000. - 434 с.

4. Симонов Е.А., Найденова Л.Ф., Ворнаков С.А. Справочник «Наркотические средства и психотропные вещества, контролируемые на территории РФ» / Под ред. В.В. Рогозина. - Одобрен ПККН М, 2003. - 411 с.

5. Фармацевтическая химия : учебное пособие / под ред. А.П. Арзамасцева.

– М. : ГЕОТАР-МЕДИА, 2008. – 640 с.

Учебное издание Илларионова Елена Анатольевна Сыроватский Игорь Петрович

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ИЗ ГРУППЫ ТРАНКВИЛИЗАТОРОВ



Похожие работы:

«Перейти в содержание Вестника РНЦРР МЗ РФ N12.  Текущий раздел: Урология Чрескожная пункционная нефролитотрипсия у больных с различными аномалиями почек. Джафар-заде М.Ф. 1,, Мартов А.Г. 1,2, Дутов С.В. 3 "Российс...»

«ВОРОБЬЕВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА КЛИНИКО-НЕЙРОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ДИСКОГЕННЫХ РАДИКУЛОПАТИЙ В СТРУКТУРЕ ДОРСОПАТИЙ ПОЯСНИЧНО-КРЕСТЦОВОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ 14.01.11.нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук профессор ЖИВОЛУП...»

«УДК 615.89 ББК 53.59 А65 Андреева, Е. А. Лечение заболеваний печени и желчного пузыря / А65 Е. А. Андреева. — М. : РИПОЛ классик, 2010. — 64 с. — (Здоровый образ жизни и долголетие). ISBN 978 5 7905 4967 0 С помощью народной медицины успешно лечатся самые разнообразные заболевания, в том числе болезни печени и желчного пузы...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" (НИУ "БелГУ") МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ ЦМК КЛИНИЧЕСКИХ ДИСЦИПЛИН РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО МОДУЛЯ ПМ.04 "МЕДИЦИНСКАЯ И МЕДИКО-СОЦИАЛЬНАЯ ПОМО...»

«КОЖЕВНИКОВ САВВА ЕЛИЗАРОВИЧ (14.09.1903 – 23.10.1962) прозаик, очеркист, публицист, литературовед, член Союза писателей СССР, главный редактор журнала "Сибирские огни" Ф.Р-2370 ЛИЧНЫЕ ФОНДЫ УЧАСТНИКОВ ВЕЛИКОЙ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ ВОЙНЫ Савва Елизарович Кожевников родился 14 с...»

«НЕФРОТИЧЕСКИЙ СИНДРОМ Учебное пособие СОДЕРЖАНИЕ 1. Протеинурия 1.1Клубочковая протеинурия 1.2 Канальцевая протеинурия 1.3 Протеинурия переполнения 1.4 Функциональная протеинурия 2. Нефротический синдром.2.1 Определение и критерии 2.2 Классификация 2.3 Этиология 2.4 Патогенез 2.5 Кл...»

«УДК 796.034.6 ВЛИЯНИЕ ПИНЕАЛОНА НА РЕЗЕРВНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ОРГАНИЗМА ВЫСОКОКВАЛИФИЦИРОВАННЫХ СПОРТСМЕНОВ А.В Лысенко1, Е.В. Моргуль1 Проблемы модернизации психофизиологического и О.А. Петрова1, И.А. Лебедева1 биохимического контроля и повышения эффективности Д.С. Лысенко2, Л.С. Кози...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Департамент кадровой политики и высшего образования ФГБОУ ВПО Самарская государственная сельскохозяйственная академия Факультет биотехнологии и ветеринарной медицины МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОРГАНИЗАЦИИ И ПРОВЕДЕНИЮ УЧЕБНЫХ И ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ ПРАКТИ...»

«Пенталгин-Icn таблетки №12 Действующее вещество: Метамизол натрий, комбинации с психолептиками Лекарственная форма: Таблетки Фармакотерапевтическая группа: Аналгетики та антипiретики. Состав действующие вещества: метамизол натрия, парацетамол, кофеин, кодеина фосфат, фенобарбитал; 1 таблетка содержит метамизола натрия 300 мг, парац...»

«При поддержке: Одесский национальный морской университет Московский государственный университет путей сообщения (МИИТ) Украинская государственная академия железнодорожного транспорта Научно-исследовательский проектно-конструкторский и...»

«Ибн Каййим Аль-Джаузи МЕДИЦИНА ПРОРОКА перевод с арабского Дауд Кадыров Ибн Каййим Аль-Джаузи "Медицина Пророка". 1-е издание. Перевод с арабского. Приложение. Айдар Хабибуллах "Хадж и здоровье паломника". 2-е издание. М.: ООО "Издательская группа "САД", 2005. – 174с. ISBN 5-902855-05-5 Всевышний Аллах повелевает: "Еш...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Россий...»

«International Scientific Journal http://www.inter-nauka.com/ Медицинские науки УРАЗАЕВА САЛТАНАТ ТУРАКОВНА к.м.н., доцент, руководитель кафедры эпидемиологии ЗКГМУ имени Марата Оспанова, г. Актобе НУРМУХАМЕДОВА ШАРА...»

«Приложение №1 к распоряжению от 30.03.2012 № 85/Q Описание типового страхового продукта "Семейная медицина"1. Общие положения.1.1. Все программы страхового продукта "Семейная медицина" объединяет то, что основная медицинская помощь оказывается врачами семейной медицины, а для детей – наблюдающими педиатрами. Программы страховог...»









 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.