WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

«А.А. Филимонова, Л.Е. Зиганшина, А.А. Чичиров УЛУЧШЕННАЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОФЕИНА И ЕГО ПЕРВИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В СЛЮНЕ И ПЛАЗМЕ. ...»

А.А. Филимонова, Л.Е. Зиганшина, А.А. Чичиров

УЛУЧШЕННАЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОФЕИНА

И ЕГО ПЕРВИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В СЛЮНЕ И ПЛАЗМЕ.

Казанская государственная медицинская академия, Казань

Изоферменты системы цитохрома Р-450(CYP-450) составляют

основную группу энзимов, участвующих в окислении лекарственных средств и других химических веществ. Экспрессия изоферментов цитохрома зависит как от генетических, так и от внешних факторов (пол, возраст, раса, образ жизни, питание и т.д.). Фенотипирование и генотипирование позволяют прогнозировать ответ на введение лекарственного средства и, следовательно, повысить эффективность лечения, устранить нежелательные лекарственные реакции.

Фенотипирование изоферментов системы цитохрома P450 позволяет измерять в реальном времени активность фермента.

Кофеин (1,3,7-диметилксантин) подвергается метаболизму в системе изоферментов цитохрома Р450. Основной путь метаболизма – это 3с образованием параксантина (1,7N-деметилирование диметилксантин), 1-N-деметилирование до теобромина (3,7диметилксантин) и 7-N-деметилирование до теофиллина (1,3диметилксантин). 1,3,7-Триметилмочевая кислота, образующаяся по пути завершает четверку первичных 8-гидроксилирования, метаболитов кофеина. Изофермент цитохрома Р450 2Е1 участвует в реакции 1-N-деметилирования и 7-N-деметилирования кофеина. 8Гидроксилирование катализируется в основном изоферментом CYP3А4 с небольшим участием CYP2E1 и CYP1A2. Параксантин в свою очередь является маркерным субстратом изофермента CYP1A2.

Процентное соотношение параксантина, теобромина и теофиллина составляет 78±11, 14±7,9 и 8±3,6% от N-деметилированных продуктов, соответственно. Оставшаяся часть кофеина превращается в 1,3,7-триметилмочевую кислоту и выводится без изменения (экскреция) [7].

Использование кофеина в качестве тест-субстрата для фенотипирования изоферментов системы цитохрома Р-450 позволяет оценить активность сразу трех изоферментов одновременно. Кофеин традиционно рассматривается как безопасный препарат, и принимаемый перорально быстро абсорбируется, подвергается метаболизму в системе изоферментов цитохрома Р450 и выводится с мочой. Отмечаются хорошие корреляции между концентрациями кофеина в слюне и плазме.

Материалы и методы Аналитическое оборудование Высокоэффективный жидкостный хроматограф (модель Shimadzu LCAS), УФ-детектор (модель Shimadzu SPD-10 A), колонка для ВЭЖХ Диасфер-110-С18, 5 мкм, 4,6250 мм, предколонка, самописец (модель Shimadzu).

Реагенты Кофеин, теофиллин, теобромин, параксантин, 1,3,7-триметилмочевая кислота, 7--гидроксиэтилтеофиллин, использовавшиеся для анализа были получены из Sigma-Aldrich Chemical Co. Все реагенты имели степень чистоты – для хроматографии.

Условия хроматографирования Были воспроизведены условия хроматографирования, описанные в

–  –  –

хроматографирования приведены в таблице 1.

Таблица 1. Условия хроматографирования кофеина и первичных метаболитов по литературным и собственным методикам.

–  –  –

НА – натрия ацетат, НДГФ –натрия дигидрофосфат, УК – уксусная кислота, ФК – фосфорная кислота, АА – аммония ацетат, ДХМ – дихлорметан, МК – муравьиная кислота.

В конце каждого дня работы колонка промывалась смесью метанола с ацетонитрилом (1/1) при скорости потока 0,2 мл/мин в течение 12 часов.

Стандартные растворы Для каждой из методик (табл. 1) были построены калибровочные графики в координатах высота пика - концентрация для стандартных растворов шести определяемых веществ в пределах концентраций от 1 до 20 мкмоль/л (n = 7). Во всех случаях получены прямые с коэффициентом корреляции R2 0,99. Другие параметры в таблицах

–  –  –

Отбор образцов Каждый пациент принимал 200 мг кофеина, растворенного в стакане воды внутрь до завтрака. За 24 часа до проведения теста пациентов просили воздержаться от употребления кофе, чая, какао, шоколада, кофеинсодержащих газированных напитков. Через 30 мин, 1 ч, 1,5 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 24 ч после приема кофеина проводили забор образцов крови и слюны.

Обработка образцов К 300 мкл плазмы или слюны добавили 100 мкл 10 мкмоль/л раствора внутреннего стандарта (7--гидроксиэтилтеофиллина). Далее образцы обрабатывали по одной из следующих методик.

1. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 300 мкл ацетонитрила с метанолом (1/1) к 300 мкл образца. [собственная

–  –  –

2. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 300 мкл ацетонитрила к 300 мкл образца. [3].

3. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 2% раствора цинка сульфата к 300 мкл образца. [2].

4. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 100 мкл 1 mol/l хлороводородной кислоты и 3 мл дихлорметана к 300 мкл

–  –  –

5. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 12 мл 20% 2-пропанола в хлороформе к 300 мкл образца. [8].

6. Белки плазмы или слюны осаждали путем добавления 4 мл хлороформа/изопропанола и 120 мг аммония сульфата к 300

–  –  –

Полученную смесь перемешали 10 сек в блендере. [4].

Центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин. Супернатант выпарили досуха и сухой остаток растворили в мобильной фазе. 15 мкл полученного образца ввели в ВЭЖХ колонку Результаты и обсуждение.

Из вида полученных нами хроматограмм следует, что первичная обработка биологического материала влияет на результаты анализа кофеина, его метаболитов и внутреннего стандарта. Мы проверили известные литературные методики обработки образцов слюны и плазмы и предложили оригинальную методику[методика 1]. Этот способ относительно прост в техническом исполнении, обеспечивает

–  –  –

значительного увеличения разрешения, т.е. лучшего определения веществ и увеличения высоты пиков.

Мы провели сравнительный анализ различных экспериментальных

–  –  –

внутреннего стандарта. В опытах варьировался состав, рН мобильной фазы, длина волны УФ-детектора, параметры элюции. Основные характеристики методик приведены в таблице 1. Результаты хроматографического определения кофеина, его первичных метаболитов и стандарта приведены в таблице 2 и 3.

Таблица 2. Время удержания кофеина и первичных метаболитов (мин) по разным методикам хроматографирования.

Скорость потока мобильной фазы 1,0 мл/мин.

–  –  –

триметилмочевая кислота, Из данных таблицы 2 видно, что на скорость выхода веществ и степень разделения решающее влияние оказывает количество и состав органической фазы. Мобильная фаза, описанная в методике [3], состоит из ацетатного буфера и ацетонитрила(85/15). При данных условиях 1,3,7-триметилмочевая кислота, параксантин, теофиллин сливаются в один пик. Если вместо ацетонитрила использовать метанол[6], можно получить все шесть пиков, но время выхода веществ значительно удлиняется (кофеин определяется только на 36 минуте, при скорости потока мобильной фазы 2,0 мл/мин). При использовании только метанола, без добавления ацетонитрила, пики уширяются и снижаются. Ацетонитрил ускоряет выход кофеина и его метаболитов, а метанол, в свою очередь, способствует лучшему разделению этих веществ. Следовательно, для лучшего результата нужно использовать в органическом компоненте как метанол, так и ацетонитрил. Водная фаза должна иметь слабокислую реакцию. Для этого используют аммония ацетат, натрия ацетат, фосфатный буфер, уксусную кислоту. При этом не имеет существенного значения для вида хроматограмм, какое вещество используется. Некоторые авторы указывают на возможность разделения шести веществ при работе с мобильной фазой, состоящей из формиатного буфера, метанола и дихлорметана. В своей методике они предлагают использовать 1,3,7триметилмочевую кислоту и 7--гидроксиэтилтеофиллин в качестве внутренних стандартов, считая, что в слюне и плазме находится незначительное количество 1,3,7-триметилмочевой кислоты. Однако, наши исследования показывают, что 1,3,7-триметилмочевая кислота определяется в биологических жидкостях. Другая сложность при использовании данной мобильной фазы – это работа с дихлорметаном, который очень нестоек и при малейшем контакте с воздухом образует множество побочных продуктов окисления, загрязняющих ВЭЖХ систему.

Для наших требований (необходимость разделения шести веществ, параметры ВЭЖХ колонки, длина волны, параметры элюации) мы подобрали сложную трехкомпанентную мобильную фазу, состоящую из 1% уксусной кислоты, метанола, ацетонитрила в объемном соотношении 84,3/8,8/6,9. Удовлетворительное разделение, скорость выхода и точность определения имели решающее значение. При длине волны 273 нм у кофеина максимум поглощения. Абсорбция для кофеина и метаболитов была в 2,5 раза выше при длине волны 273 нм, чем при длине волны 254 нм. Предел детектирования составил 0,2 мкмоль/л для всех определяемых веществ.

На рисунке 1 представлены хроматограммы стандартного раствора шести определяемых веществ и образец слюны человека через 9 часов после приема кофеина. Видно, что разделение и формы пиков четкие, исключающие неоднозначное определение исследуемых веществ.

–  –  –

метаболитов с концентрацией 10 мкмоль/л (а) и слюны человека через 9 часов после приема кофеина (б). Условия хроматографирования – методика №11 табл. 1. Пики: теобромин(1), параксантин(2),

–  –  –

гидроксиэтилтеофиллин(5), кофеин(6).

Заключение В проведенном исследовании мы провели сравнительную оценку известных способов обработки биологических образцов и условий хроматографирования. На основании проведенного опыта получена новая улучшенная методика ВЭЖХ анализа, включающая в себя

–  –  –

84,3/8,8/6,9. Скорость потока мобильной фазы – 2,0 мл/мин, длина волны детектирования – 273 нм.

Представленная методика имеет следующие преимущества: простая процедура обработки биологических образцов, хорошее разделение веществ на выходе из колонки, высокая специфичность и чувствительность, сравнительно небольшое время выхода, разделение одновременно шести продуктов, позволяющее оценить активность

–  –  –

1. Хроматография. Продукты для анализа и очистки. SUPELCO.

2003-2004

2. Alkaysi H.N., Salem M.S. J. Clin. Pharmacy Ther., 1988, 13, 109-115.

3. Blanchard J., Mohammadi J.D. Clin. Chem., 1980, 26/9, 1351-1354

4. Bonati M., Latini R. Clin. Pharmacol. Ther., 1982., 32(1), 98-106

5. Carillo J., Christensen M. Ther. Drug. Monit. 2000; 22: 409-417

6. Christensen M. Clin. Pharmacol. Ther., 003., 73(6), 517-528

7. Daniel W.A., Syrek M. Pol. J. Pharmacol., 2001, 53, 351-357

8. Haughey D.B. J. Chromatogr., 1982, 229, 387-395

9. Setchell K.D.R., Welsh M.B. J. Chromatogr., 1987, 385, 267-274

10.Tanaka E. J. Chromatogr., 1992, 575, 311-314

11.Wahllander A., Renner E. J. Chromatogr., 1985, 338, 369-375.

А.А. Филимонова, Л.Е. Зиганшина, А.А. Чичиров

УЛУЧШЕННАЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОФЕИНА

И ЕГО ПЕРВИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В СЛЮНЕ И ПЛАЗМЕ.

Казанская государственная медицинская академия, Казань Мы провели сравнительный анализ известных методик ВЭЖХ определения кофеина и его первичных метаболитов в слюне и плазме при пероральном введении. В результате поведенных исследований мы разработали новую, специфичную и чувствительную методику ВЭЖХ анализа кофеина и его основных метаболитов, отличительной особенностью которой является одновременное разделение шести веществ с возможностью определения активности изоферментов

Похожие работы:

«Учебная деятельность кафедры неврологии, мануальной терапии и рефлексотерапии Главной задачей кафедры неврологии, мануальной терапии и рефлексотерапии является последипломное образование врачей, обучение в годичной интернатуре, двухгодичной клинической ординатуре и аспирантуре по специальностям "невролог...»

«ЭПИЗООТОЛОГИЯ, ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И МОНИТОРИНГ ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ Поступила в редакцию 19.01.2015 УДК 619:616.995.132 Принята в печать 14.03.2015 DOI: 10.12737/11770 З. Т. Байсарова, С. Т. Айсханов. Динамика заражения телят основными видами нематод в ус...»

«mini-doctor.com Инструкция Вокасепт сироп по 100 мл во флаконе ВНИМАНИЕ! Вся информация взята из открытых источников и предоставляется исключительно в ознакомительных целях. Вокасепт сироп по 100 мл во флаконе Действующее вещество: Д...»

«Министерство здравоохранения Mосковской области Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области Московский областной научно-исследовательский клинический инс...»

«Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации 2.6.5. Атомная энергетика и промышленность Контроль радиационной обстановки. Общие требования Методические указания МУ 2.6.5.008-2016 Издание официальное Москва МУ...»

«РОССИЙСКАЯ АССОЦИАЦИЯ АЛЛЕРГОЛОГОВ И КЛИНИЧЕСКИХ ИММУНОЛОГОВ (РААКИ) Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению аллергического контактного дерматита сентябрь 2014 Москва, 2014 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ антигистаминные препараты АЗ аллергические заболевания АкД аллергический к...»

«Светлана Галсановна Чойжинимаева Как жить не болея. Из практики врача тибетской медицины Текст предоставлен издательством "АСТ" http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=653435 Как жить не болея: из пр...»

«СОСТАВИТЕЛИ: С.Л. Кабак, профессор кафедры морфологии человека Учреждения образования "Белорусский государственный медицинский университет", доктор медицинских наук, профессор; Н.В. Синельникова, заведующий кафедрой морфологии человека Учреждения образования "Белорусский государственный медицинский университет", кандидат медицинских н...»

«ЗАНЯТИЕ№5 Итоговое занятие по теме: "ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ СИСТЕМЫ КРОВИ" В О П Р О С Ы: 1. Понятие о системе крови, объеме циркулирующей крови (ОЦК). Факторы, обеспечивающие поддержание ОЦК.2. Понятие о гематокритном показателе. Методика его определения и клиническое значение. Виды нарушения объема ци...»









 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.