«Автоматизация полного цикла молекулярно-генетической диагностики туберкулеза и определения лекарственной устойчивости МБТ на основе ПЦР в ...»

Автоматизация полного цикла

молекулярно-генетической диагностики

туберкулеза и определения лекарственной

устойчивости МБТ на основе ПЦР в

реальном времени

Аляпкина Ю.С.1, Смирнова Т.Г.3, Варламов Д.А.1, Фомичева С.Н.2, Андреевская

С.Н.3, Ларионова Е.Е.3, Черноусова Л.Н.3

НПФ «Синтол», ООО «Текан», ЦНИИ Туберкулеза, Москва

Проблема

Для диагностики туберкулеза в настоящее время

широко применяются молекулярно-генетические

методы исследования, позволяющие существенно

сократить сроки выявления МБТ и определения ЛУ, по сравнению с традиционными микробиологическими методами.

В основе молекулярно-генетических методов исследования лежит метод ПЦР, позволяющий амплифицировать нужный регион ДНК.

Этапы ПЦР-анализа пробоподготовка образца выделение НК амплификация анализ амплифицированной ДНК Трудности выделения ДНК из диагностического материала, полученного от больных туберкулезом

1. Разнообразие диагностического материала.

2. Характер диагностического материала – вязкая мокрота, содержащая большое количество муцинов, ингибиторов ПЦР и др.; оперматериал, жидкости

3. Сложное строение клеточной стенки представителей рода Mycobacterium ПОЭТОМУ для выделения ДНК микобактерий из диагностического материала необходимо использовать многошаговые методы выделения ДНК Parsons, L.M., et al. 1997 Infect. Dis. Clinics N.A. 11:905-928 Особенности выделения ДНК из диагностического материала, полученного от больных туберкулезом Многоэтапный трудоемкий монотонный процесс Занимает много времени Требует высокой концентрации внимания лабораторного работника Допущение небрежности может привести к контаминации одного образца другим и получению ложноположительного результата.

Для совершенствования процесса и снижения трудозатрат на этапе выделения ДНК возможно использование роботизированных станций Выбор системы для автоматического выделения ДНК Открытость системы Возможность использовать разные типы одноразового пластика, имеющегося на отечественном рынке Программное обеспечение, позволяющее изменять любые параметры движения, набора и сброса жидкости без вызова сервисного инженера Свободная конфигурация рабочего стола ЦНИИТ – СИНТОЛ – ТЕCAN Совместный проект ЦНИИ Туберкулеза, компаний «TECAN» и «СИНТОЛ» по созданию автоматического варианта выделения ДНК из клинических образцов, либо культуры клеток для проведения ПЦР-диагностики туберкулеза.

В настоящий момент это единственное в России полностью автоматизированное решение для выделения ДНК и раскапывания ПЦР-смеси для анализа микобактерий туберкулеза, использующее отечественные реагенты.

Основные задачи, которые необходимо было решить для внедрения роботизированной станции

Предотвратить возможность контаминации при выделении ДНК вследствие работы с открытыми пробирками Эффективность выделения ДНК в автоматической станции не должна уступать эффективности выделения ручным способом Биобезопасность При работе вне ламинарного бокса с диагностическим материалом, содержащим живые микобактерии, необходимо:

В условиях ШББ 2-го класса биобезопасности инактивировать МБТ ДНК должна оставаться пригодной для последующей постановки ПЦР

Предобработка инактивирующим раствором повышает выход ДНК при выделении и, следовательно, чувствительность анализа по сравнению со стандартной предобработкой NaOH-NALC более чем в 10 раз.

Полная сохранность ДНК при транспортировке и хранении клинического материала в течение 1 месяца Проверка бактерицидных свойств инактивирующего реагента А и подбор условий предобработки диагностического материала (ФГБУ ЦНИИТ РАМН)

Планирование рабочего стола Программирование – подбор скорости забора и слива жидкости Для каждого реагента из набора для выделения были заданы параметры, позволяющие точно набирать жидкость в зависимости от ее свойств.

выделение ДНК основано на сорбции ДНК на оригинальных магнитных частицах; магнитные частицы обладают хорошими сорбирующими свойствами, причем нуклеиновые кислоты связываются с ними лучше, чем другие соединения, что способствует получению более чистого раствора ДНК включает внутренний положительный контроль (ВПК), позволяющий контролировать ингибирование ПЦР-РВ и эффективность выделения Эффективность автоматического выделения по сравнению с ручным

36 – ПЦР + 36 – ПЦР + 14 – ПЦР - 14 – ПЦР Получены идентичные результаты эффективность автоматического выделения доведена до уровня ручного выделения Внедрение роботизированной раскапывающей станции Freedom Evo 150 (Tecan) в лабораторную практику ЦНИИТ РАМН С января 2012 года выделение ДНК и внесение ДНК в ПЦР-смесь проводится в роботизированной системе Tecan Fredom EVO 150 Диагностический материал: мокрота, плевральная жидкость, БАЛ, браш-биопсия, операционный материал, кровь, моча.

Прибор адаптирован для работы как с нативным материалом, так и с осадком обработанных для посева образцов.

Одновременно возможно выделять ДНК из 48 образцов.

Время выделения 1 час 40 минут.

Автоматизация полного цикла молекулярно-генетического анализа МБТ

Спасибо за внимание!