WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

«1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ Система детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени «Rotor-Gene» представляет собой программируемый термостат (амплификатор), сопряженный с оптической системой детекции ...»

Проведение ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени при помощи

прибора «Rotor-Gene 3000» (Corbett Research)

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Система детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени «Rotor-Gene» представляет собой

программируемый термостат (амплификатор), сопряженный с оптической системой детекции флуоресцентного

сигнала по 4 каналам через дно пробирки. Одна загрузка прибора (в зависимости от типа установленного ротора)

может составлять 36 пробирок по 200 мкл или 72 пробирки по 100 мкл. Система позволяет проводить ПЦР и регистрировать сигнал от образцов по заданным каналам в каждом цикле. По окончании реакции управляющая программа строит кривые накопления фонового сигнала от каждого образца в каждом из задействованных каналов, по которым в дальнейшем и производится анализ результатов. Для работы с наборами ФЛУОРОПОЛ используются каналы FAM (специфический сигнал) и JOE/HEX (сигнал внутреннего контроля).

В данном приложении указаны только операции, необходимые для использования прибора и его программного обеспечения для работы с наборами ФЛУОРОПОЛ. За дополнительной информацией следует обращаться к инструкции по использованию прибора или к его изготовителям.

2. ПЕРЕД ПЕРВЫМ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

Создание протокола амплификации

2.1. Запустить управляющую программу. После запуска программа выведет окно выбора протоколов

2.2. На вкладке Advanced (1) нажать кнопку New (2).

Программа перейдет к мастеру создания протокола.

2.3. В поле (1) выбрать использующийся тип ротора и нажать кнопку Next (2)

2.4. В поле (1) задается оператор, в поле (2) при необходимости можно ввести комментарий к протоколу. В поле Reaction Volume (3) следует задать объем реакционной смеси – 25 мкл.

Нажать кнопку Next (4)

2.5. Для введения температурного профиля амплификации нажать кнопку Edit Profile… (1). Программа амплификации для проведения любых тестов при помощи наборов ФЛУОРОПОЛ на данном приборе следующая:

Стадия Температура Время шага Считывание Hold 94 deg 1 mins 30 secs 94 deg 10 secs Don’t Acure Cycling 64 deg 10 secs Don’t Acure 72 deg 40 secs Don’t Acure This cycle repeats Acuiring to Cycle A 40 times 50 deg 15 secs on FAM/SYBP, JOE В поле (5) окна Edit Profile кнопками (6) задать стадии согласно таблице и рисунку.

Выбрать в поле (5) стадию Hold.

Указать параметры шага (7) согласно таблице.

Из списка Rotor Speed:

(8) выбрать Normal Speed.

–  –  –

стадию Cycling.

Задать число циклов (9) равным 40 (см. таблицу и рисунок).

Кнопками (10) задать нужное число шагов внутри цикла (см. таблицу и поле (12) рисунка).

Для каждого шага выбрать из списка (11) Timed Step, задать параметры шага (13) и (14) согласно таблице.

Флажки для параметров Long Range и Touchdown (15) должны отсутствовать.

Для определения каналов считывания FAM и JOE нажать кнопку (14).

Программа выдаст следующее окно:

Для всех шагов в цикле, кроме последнего, нажать кнопки Don’t Acure (17) и Ok (21).

Для последнего шага в цикле, необходимо поместить в список Acquiring Channels: (20) каналы FAM/SYBR и JOE.

Доступные незадействованные каналы выбираются из списка Available Channels: (18) и перемещаются кнопками (19). По завершении выбора нажать кнопку Ok (21).

После завершения создания протокола нажать кнопку Ok (16).

2.6. Выбрать в списке Channel Setup:

канал FAM/SYBR и нажать кнопку Calibrate… (2).

Программа перейдет к окну Auto Gain Calibration Setup.

Нажать кнопку Calibrate Acquiring (22).

Поставить флажок (23). Флажка (24) стоять не должно!

В списке 25 выбрать канал FAM/SYBR и нажать кнопку

Edit (26). Выставить настройки согласно рисунку ниже:

Нажать кнопку Ok.

Повторить предыдущий п.п. для канала JOE Закрыть окно Auto Gain Calibration Setup.

Нажатием кнопки Next (3) перейти к следующему окну.

2.7. В последнем окне мастера создания протокола можно проверить параметры протокола амплификации. В некоторых версиях ПО там же расположена кнопка сохранения протокола:. Если такая кнопка отсутствует, закройте окно мастера и в главном окне программы выберите File\Save As…\Template… (см. рис.).

–  –  –

3.1.1. Приготовить и промаркировать (маркировка наносится на крышку) пробирки для проведения амплификации, соответствующие рекомендациям производителя прибора, включая пробирки для положительного контрольного образца ДНК и отрицательного контрольного образца.

3.1.2. За 20-30 мин до приготовления амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для амплификации из морозильника, разморозить содержимое. Пробирку с реакционной смесью тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого.

Внимание! При приготовлении амплификационной смеси необходимо все компоненты добавлять отдельными наконечниками!

3.1.3. Приготовить рабочую смесь, смешав нужные количества разбавителя, реакционной смеси и Taqполимеразы согласно таблице и тщательно перемешать пипетированием (если объем смеси 200 мкл) или вортексированием.

Внимание! Taq-полимеразу следует добавлять в последнюю очередь.

Количество пробирок 5 10 15 20 Разбавитель, мкл (15 мкл/ пробирка) 75 150 225 300 5х реакционная смесь, мкл (5 мкл/пробирка) 25 50 75 100 Taq-полимераза, мкл (0,2 мкл/пробирка) 1,0 2,0 3,0 4,0 3.1.4. Внести в приготовленные пробирки, по 20 мкл полученной рабочей смеси.

3.1.5. Добавить во все пробирки по 15-20 мкл минерального масла.

3.1.6. Добавить во все пробирки индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами по 5 мкл:

а) в пробирку отрицательного контрольного образца – разбавитель;

б) в пробирки исследуемых образцов – исследуемые образцы ДНК;

в) (для количественного анализа) в пробирки стандартных образцов – стандартные образцы с известной концентрацией ДНК (в состав набора не входят).

г) в пробирку положительного контрольного образца – положительный контрольный образец ДНК из комплекта набора.

Для снижения риска контаминации образцы следует добавлять в указанном порядке. Пробирку, в которую был внесен образец, следует по возможности немедленно закрывать крышкой.

3.1.7. Пробирки закрыть и установить в прибор, уравновесив ротор (если уравновешивание одними лишь амплификационными пробирками невозможно, следует использовать аналогичные пробирки с водой). Прижать крышки пробирок прижимным кольцом.

3.2. Комплектация «One Step»

3.2.1. Достать пробирки с амплификационной смесью, положительным контролем и разбавителем из холодильника в соответствии с количеством анализируемых образцов.

При необходимости, если часть раствора находится на внутренней стороне крышки пробирки, отцентрифугировать пробирки 3-5 сек на микроцентрифуге-вортексе.

3.2.2. Расставить пробирки в указанном в протоколе измерений порядке.

3.2.3. Добавить во все пробирки индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами по 5 мкл:

а) в пробирку отрицательного контрольного образца – разбавитель;

б) в пробирки исследуемых образцов – исследуемые образцы ДНК;

в) (опциально; необходимо для количественного анализа) в пробирки стандартных образцов стандартные образцы с известной концентрацией ДНК (в состав набора не входят).

г) в пробирку положительного контрольного образца – положительный контрольный образец ДНК из комплекта набора.

Для снижения риска контаминации образцы следует добавлять в указанном порядке. Пробирку, в которую был внесен образец, следует по возможности немедленно закрывать крышкой.

3.3. Пробирки плотно закрыть и перенести в прибор.

Внимание! В 1 гнезде ротора обязательно следует установить пробирку с положительным контрольным образцом – это необходимо для калибровки прибора. Если в барабане установлены пробирки относящиеся к разным тестам, выбор устанавливаемого в 1 гнездо положительного контрольного образца не имеет значения и остается на выбор пользователя.

3.4. Открыть окно New Run (автоматически запускается при старте программы, либо вызывается из основной панели инструментов главного окна программы

File\New…):

На вкладке Advanced (1) выбрать созданный ранее протокол (2) и дважды кликнуть по нему.

3.5. В списке (1) проверить тип ротора. При использовании 200 мкл пробирок с плоскими крышками поставить флажок (2).

Нажать на кнопку Next (3).

Пропустить все последующие окна, нажимая Next до появления последнего окна мастера:

3.6. Убедиться, что все настройки соответствуют заданным и нажать кнопку Start Run (1). Программа запросит имя файла, в котором будет сохранён прогон.

3.7. Создание и редактирование протокола расположения образцов

С началом прогона программа выведет окно мастера редактирования расположения образцов в роторе:

Расположение и описание образцов можно полностью задать в предложенном окне мастера. Однако, эту операцию можно и отложить, проведя позже в любой момент прогона, после его окончания или при анализе полученных результатов. Для этого окно мастера следует закрыть нажатием на кнопку Finish (1).

Внимание! Закрытие окна мастера нажатием кнопки Finish and Lock Samples приведет к фиксированию введенной информации и невозможности ее дальнейшей корректировки. Использование этой кнопки допустимо только в том случае, если есть полная уверенность, что введенную информацию далее корректировать не придется!

Продолжить редактирование расположения и описания образцов можно из главного окна программы, когда ни один из мастеров не является активным. Для этого в правой части окна следует нажать кнопку Edit Samples…(11).

Выдаваемое при этом окно является полным функциональным аналогом окна мастера.

Примечание. Вид и функциональное назначение поля (2) может значительно меняться в зависимости от того, для редактирования какого столбца оно используется.

3.7.1. Выделить в столбце Name (3) клетку, соответствующую положению редактируемого образца. В строке (2) задать название пробы.

3.7.2. Выделить в столбце Type (4) клетку, соответствующую положению редактируемого образца. Из выпадающего списка (2) выбрать тип образца:

Тип Значение None отсутствие пробирки в гнезде Unknown исследуемый образец стандартный образец с известной Standard концентрацией Positive Control положительный контрольный образец Negative Control отрицательный контрольный образец 3.7.3.

Если в постановке присутствуют стандартные образцы, то необходимо выполнить следующие действия:

из списка Unit: (5) выбрать единицы измерения концентрации стандартов;

из списка Given Conc. Format: (6) выбрать предпочтительный формат задания концентрации;

в столбце Given Conc. (7) ввести концентрации для каждого стандартного образца.

3.7.4. Сгруппировать пробирки согласно проводимым в них тестам. Для этого:

Нажать кнопку More Options (8) В окне Samples – More Options нажать кнопку Define Groups

–  –  –

В появившемся окне Edit Group задать в поле Code: краткое обозначение теста, в поле Name: можно указать полное название.

Нажать кнопку OK.

Закрыть последовательно окна Define Groups и Samples – More Options.

При отнесении пробирок к группе, программа автоматически удаляет из списка те группы, к которым не отнесена ни одна пробирка. Поэтому одновременное задание нескольких групп является нецелесообразным.

В столбце Groups (9) выделить ячейки, соответствующие образцам, для которых была создана группа.

Нажать кнопку (10).

В появившемся окне Groups поставить флажок для выбранного теста.

Нажать кнопку OK.

Повторить все описанные в п. 3.7.4. действия для остальных проводимых в рамках сессии тестов.

4. ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

Детекция продуктов амплификации осуществляется прибором автоматически в каждом цикле амплификации.

На основании этих данных управляющая программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналов.

5. АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. По окончании амплификации нажать в главном окне кнопку Analysis (1).

5.2. В появившемся окне Analysis выбрать вкладку Quantitation (2), выделить надпись Cycling A. FAM/Sybr (3) и нажать кнопку Show (4).

5.3. В окне Analysis на вкладке Quantitation (2), выделить надпись Cycling A. JOE (3) и нажать кнопку Show (4).

5.4. Закрыть окно Analysis.

В главном окне программы появится 6 окон:

5.5. Сделать активными в поле (1) все образцы, относящиеся к одному тесту.

5.6. Максимизировать окно Quantitation Analysis – Cycling A. FAM/Sybr кнопкой (2).

5.7. Установить следующие параметры обработки (см. рис.):

кнопка (5) – Log Scale;

кнопка Dynamic Tube (6) – нажата;

кнопка Slope Correct (7) – нажата;

поле Eliminate Cycles before (10) – 10;

нажать кнопку Ignore First (8) и установить в поле Cycles окна Ignore First значение 3. Нажать кнопку OK.

5.8. Нажать кнопку More Settings… (9) и в открывшемся окне Quantitate Settings установить следующие значения:

флажок Enabled в рамке Reaction Efficiency Threshold:

(14) – снят;

в поле % рамки NTC Threshold: – значение из таблицы, соответствующее выбранному каналу и тесту.

–  –  –

Нажать кнопку OK (15)

5.9. Задать в поле Threshold (11) значение из таблицы, соответствующее выбранному каналу и тесту.

5.10. Вернуть окну обычный размер кнопкой (12).

5.11. Повторить п.п. 5.6.-5.10. для окна Quantitation Analysis – Cycling A. JOE (3).

Примечание. Поскольку во всех тестах используется единая система внутреннего контроля, то настройки для канала JOE задаются 1 раз за сессию.

5.12. Нажать на панели инструментов главного окна кнопку Reports (4).

5.13. В появившемся окне Report Browser следует выбрать тип обработки и канал, по которым будет создаваться отчет Quantitation\CyclingA.FAM/Sybr (16), а также тип отчета (17). Нажать кнопку Show (18).

5.14. Программа выведет окно Preview, в котором осуществляется просмотр отчета, а также все операции по его сохранению, экспорту в другие программы и печати. Отчет следует сохранить в наиболее удобном формате и, при необходимости, распечатать.

5.15. Закрыть окно Preview.

5.16. Повторить п.п. 5.13. – 5.15. для канала JOE (19).

5.17. Закрыть окно Report Browser.

5.18. Повторить п.п. 5.5. - 5.10. и 5.12. – 5.18. для остальных тестов, проводившихся в рамках данной сессии.

5.19. Интерпретация результатов качественного анализа производится согласно таблице (значения конечных циклов КЦ для каждого возбудителя и внутреннего контроля приведены выше):

Интерпретация результатов:

В таблице использованы следующие обозначения:

Сt FAM – цикл пересечения кривой накопления специфического флуоресцентного сигнала образца с пороговой линией;

Ct JOE (HEX) – цикл пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала внутреннего контроля образца с пороговой линией;

N/A – пересечение кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией не зарегистрировано;

КЦ – конечный цикл – пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией после него полностью аналогично ситуации, когда пересечение не зарегистрировано вовсе.

–  –  –

5.20. Интерпретация результатов количественного анализа (чувствительность наборов см. в основной части инструкции, КЦ для внутреннего контроля составляет 35 циклов):

Интерпретация результатов:

В таблице использованы следующие обозначения:

Сt FAM – цикл пересечения кривой накопления специфического флуоресцентного сигнала образца с пороговой линией;

Ct JOE (HEX) – цикл пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала внутреннего контроля образца с пороговой линией;

N/A – пересечение кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией не зарегистрировано;

КЦ – конечный цикл – пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией после него полностью аналогично ситуации, когда пересечение не зарегистрировано вовсе.

–  –  –

Внимание! Надежными можно считать численные значения только для тех образцов, значения Ct для

Похожие работы:

«Vivaldi-IB_DB98-30079A_R 12/19/2008 11:27 AM Page 1 (1, 1) Серия AQ07R Серия AQ 09R Серия AQ07C Серия AQ 09C Серия AQ12U Серия AQ18U Кондиционер руководство по эксплуатации Удивительные возможности Благодарим за приобретение продукции Samsung. Для более полного обслуживания зарегистрируйте Ва...»

«Целью вступительных испытаний по менеджменту является определение в области теоретической и практической подготовленности специалиста или бакалавра к выполнению профессиональных задач, установленных Федеральным государственным образовательным стандартом (ФГОС), то есть комплексная оценка общенаучных и профессиональных знаний...»

«41 В.А. Мазуров. Кибертерроризм: понятие, проблемы противодействия УДК 343.7 В.А. Мазуров Кибертерроризм: понятие, проблемы противодействия На основе анализа нормативных, научных и официальных источников дано определение кибертерроризма, кибертеракта, рас...»

«6 (19) июля Преподобномученик Феодор (Богоявленский) Преподобномученик Феодор родился 27 декабря 1905 года в Тегеране в семье второго секретаря Русской дипломатической миссии, назначенного впоследствии консулом в город Исфагань, Павла Георгиевича Богоявленского, и в крещении был наречен Олегом. Пав...»

«Введение. Микротрубочки играют принци УДК 577.212:004 С.А. БРЯНЦЕВА, Е.С. ГАВРЮШИНА, пиально важную роль в функционировании как животных, так и растительных клеток. Они А.И. ЕМЕЦ 3, П.А. КАРПОВ 3, Я.Б. БЛЮМ 3, необходимы для осуществления митоза и мейо Ю.Ф. ДРЫГИН 1, Е.С. НАДЕЖДИНА 2 за, для обеспечения внутрикл...»

«АДМИНИСТРАТИВНЫЙ РЕГЛАМЕНТ предоставления муниципальной услуги Признание жилых помещений пригодными (непригодными) для проживания граждан, признание многоквартирных домов аварийными и подлежащими сносу Раздел I. Общие положения Предмет регулирования 1. Административный регламент предоставления муни...»

«ИНФОРМАЦИОННАЯ БРОШЮРА ДЛЯ ПАЦИЕНТА E A D V ЧЕСОТКА task force “skin disease in pregnancy” Цель этой брошюры Эта брошюра позволит вам больше узнать о чесотке. Она расскажет вам о том, что такое чесотка, о причинах ее появления, профилактике и лечении, а также укажет, где можно найти более детальную информацию об этом забо...»







 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.