WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

«1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ Система детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени «Rotor-Gene» представляет собой программируемый термостат (амплификатор), ...»

Проведение ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени при помощи

приборов «Rotor-Gene 6000» (Corbett Research)

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Система детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени «Rotor-Gene» представляет собой

программируемый термостат (амплификатор), сопряженный с оптической системой детекции флуоресцентного

сигнала по 6 каналам через дно пробирки. Одна загрузка прибора (в зависимости от типа установленного ротора)

может составлять 36 пробирок по 200 мкл или 72 пробирки по 100 мкл. Система позволяет проводить ПЦР и регистрировать сигнал от образцов по заданным каналам в каждом цикле. Управляющая программа строит кривые накопления сигнала от каждого образца в каждом из задействованных каналов, по которым в дальнейшем и производится анализ результатов. Для работы с наборами ФЛУОРОПОЛ используются каналы Green (специфический сигнал) и Yellow (сигнал внутреннего контроля). В случае наборов для выявления ДНК двух возбудителей с дифференцировкой типа в качестве второго специфического канала также применяется и канал Orange.

В данном приложении указаны только операции, необходимые для использования прибора и его программного обеспечения для работы с наборами ФЛУОРОПОЛ. За дополнительной информацией следует обращаться к инструкции по использованию прибора или к его изготовителям.

2. ПЕРЕД ПЕРВЫМ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

Создание протокола амплификации

2.1. Запустить управляющую программу. После запуска программа выведет окно выбора протоколов



2.2. На вкладке Advanced (1) нажать кнопку New (2).

Программа перейдет к мастеру создания протокола.

2.3. В поле (1) выбрать использующийся тип ротора.

Отметить флажком тип пробирок без выпуклой крышки (No Domed Tubes).

Нажать кнопку Next (2)

2.4. В появившемся окне в поле (1) задается оператор, в поле (2) при необходимости можно ввести комментарий к протоколу. В поле Reaction Volume (3) следует задать объем реакционной смеси – 25 мкл.

Нажать кнопку Next (4)

2.5. Для введения температурного профиля амплификации нажать кнопку Edit Profile… (1). Программа амплификации для проведения любых тестов при помощи наборов ФЛУОРОПОЛ на данном приборе следующая:

Стадия Температура Время шага Считывание Hold 95 deg 1 mins 30 secs 95 deg 10 secs Don’t Acure Cycling Acuiring to Cycle A This cycle repeats 60 deg 20 secs on Green, Yellow 40 times

–  –  –

параметры шага (7) согласно таблице.

Из списка Rotor Speed: (8) выбрать Normal Speed.

Выбрать в поле (5) стадию Cycling.

Задать число циклов (9) равным 40 (см.

таблицу и рисунок).

Кнопками (10) задать нужное число шагов внутри цикла (см. таблицу и поле (12) рисунка).

Для каждого шага выбрать из списка (11) Timed Step, задать параметры шага (13) согласно таблице. Флажки для параметров Long Range и Touchdown (15) должны отсутствовать.

Для всех шагов в цикле, кроме последнего, нажать кнопку (14). В появившемся окне Acquisition выбрать функцию Don’t Acure (17).

Для последнего шага в цикле нажать кнопку (14).

Поместить в список Acquiring Channels: (20) каналы Green и Yellow.

Доступные незадействованные каналы выбираются из списка Available Channels: (18) и перемещаются кнопками (19). По завершении выбора нажать кнопку Ok (21).

После завершения создания протокола нажать кнопку Ok (16).



2.6. В последнем окне мастера создания протокола можно проверить параметры протокола амплификации.

Закройте окно мастера и в главном окне программы выберите File\Save As…\Template… (см. рис.).

3. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ

3.1. Комплектация «One Step»

3.1.1. Достать пробирки с амплификационной смесью, положительным контролем и разбавителем из холодильника в соответствии с количеством анализируемых образцов.

При необходимости, если часть раствора находится на внутренней стороне крышки пробирки, отцентрифугировать пробирки 3-5 сек на микроцентрифуге-вортексе.

3.1.2. Расставить пробирки в указанном в протоколе измерений порядке.

3.1.3. Добавить во все пробирки индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами по 5 мкл:

а) в пробирку отрицательного контрольного образца – разбавитель;

б) в пробирки исследуемых образцов – исследуемые образцы ДНК;

в) (опциально; необходимо для количественного анализа) в пробирки стандартных образцов стандартные образцы с известной концентрацией ДНК (в состав набора не входят).

г) в пробирку положительного контрольного образца – положительный контрольный образец ДНК из комплекта набора.

Для снижения риска контаминации образцы следует добавлять в указанном порядке. Пробирку, в которую был внесен образец, следует по возможности немедленно закрывать крышкой.

3.2. Комплектация «Нераскапанный».

3.2.1. Приготовить и промаркировать (маркировка наносится на крышку) пробирки для проведения амплификации, соответствующие рекомендациям производителя прибора, включая пробирки для положительного контрольного образца ДНК и отрицательного контрольного образца.

3.2.2. За 20-30 мин до приготовления амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для амплификации из морозильника, разморозить содержимое. Пробирку с реакционной смесью тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого.

Внимание! При приготовлении амплификационной смеси необходимо все компоненты добавлять отдельными наконечниками!

3.2.3. Приготовить рабочую смесь, смешав нужные количества разбавителя, реакционной смеси и Taqполимеразы согласно таблице и тщательно перемешать пипетированием (если объем смеси 200 мкл) или вортексированием.

Внимание! Taq-полимеразу следует добавлять в последнюю очередь.

Количество пробирок 5 10 15 20 Разбавитель, мкл (15 мкл/ пробирка) 75 150 225 300 5х реакционная смесь, мкл (5 мкл/пробирка) 25 50 75 100 Taq-полимераза, мкл (0,2 мкл/пробирка) 1,0 2,0 3,0 4,0 3.2.4. Внести в приготовленные пробирки, по 20 мкл полученной рабочей смеси.

3.2.5. Добавить во все пробирки по 15-20 мкл минерального масла.

3.2.6. Добавить во все пробирки индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами по 5 мкл:

а) в пробирку отрицательного контрольного образца – разбавитель;

б) в пробирки исследуемых образцов – исследуемые образцы ДНК;

в) (для количественного анализа) в пробирки стандартных образцов – стандартные образцы с известной концентрацией ДНК (в состав набора не входят).

г) в пробирку положительного контрольного образца – положительный контрольный образец ДНК из комплекта набора.

Для снижения риска контаминации образцы следует добавлять в указанном порядке. Пробирку, в которую был внесен образец, следует по возможности немедленно закрывать крышкой.

3.2.7. Пробирки закрыть и установить в прибор, уравновесив ротор (если уравновешивание одними лишь амплификационными пробирками невозможно, следует использовать аналогичные пробирки с водой). Прижать крышки пробирок прижимным кольцом.

3.3. Пробирки плотно закрыть и перенести в прибор.

Внимание! В 1 гнезде ротора обязательно следует установить пробирку с положительным контрольным образцом – это необходимо для калибровки прибора. Если в барабане установлены пробирки относящиеся к разным тестам, выбор устанавливаемого в 1 гнездо положительного контрольного образца не имеет значения и остается на выбор пользователя.

3.4. Открыть окно New Run (автоматически запускается при старте программы, либо вызывается из основной панели инструментов главного окна программы

File\New…):

На вкладке Advanced (1) выбрать созданный ранее протокол (2) и дважды кликнуть по нему.

3.5. В списке (1) проверить тип ротора.

При использовании 200 мкл пробирок с плоскими крышками поставить флажок (2).

Нажать на кнопку Next (3).

Пропустить все последующие окна, нажимая Next до появления последнего окна мастера:

3.6. Убедиться, что все настройки соответствуют заданным и нажать кнопку Start Run (1).

Программа запросит имя файла, в котором будет сохранён прогон.

3.7. Создание и редактирование протокола расположения образцов

С началом прогона программа выведет окно мастера редактирования расположения образцов в роторе:

Расположение и описание образцов можно полностью задать в предложенном окне мастера. Однако, эту операцию можно и отложить, проведя позже в любой момент прогона, после его окончания или при анализе полученных результатов. Для этого окно мастера следует закрыть нажатием на кнопку Finish (1).

Внимание! Закрытие окна мастера нажатием кнопки Finish and Lock Samples приведет к фиксированию введенной информации и невозможности ее дальнейшей корректировки. Использование этой кнопки допустимо только в том случае, если есть полная уверенность, что введенную информацию далее корректировать не придется!

Продолжить редактирование расположения и описания образцов можно из главного окна программы, когда ни один из мастеров не является активным. Для этого в правой части окна следует нажать кнопку Edit Samples…(11).

Выдаваемое при этом окно является полным функциональным аналогом окна мастера.

Примечание. Вид и функциональное назначение поля (2) может значительно меняться в зависимости от того, для редактирования какого столбца оно используется.

3.7.1. Выделить в столбце Name (3) клетку, соответствующую положению редактируемого образца. В строке (2) задать название пробы.

3.7.2. Выделить в столбце Type (4) клетку, соответствующую положению редактируемого образца. Из выпадающего списка (2) выбрать тип образца:

–  –  –

3.7.3. Если в постановке присутствуют стандартные образцы, то необходимо выполнить следующие действия:

из списка Unit: (5) выбрать единицы измерения концентрации стандартов;

из списка Given Conc. Format: (6) выбрать предпочтительный формат задания концентрации;

в столбце Given Conc. (7) ввести концентрации для каждого стандартного образца.

Внимание! Номера строк в списке образцов соответствуют номерам ячеек в роторе. Строки, соответствующие пустым ячейкам ротора,(12) не заполняются!

3.7.4. Цвет получаемой кривой можно задать, выделив строку в столбце С (13).На появившейся панели управления нажать кнопку Edit (14) и выбрать цвет.

3.7.5. Сгруппировать пробирки согласно проводимым в них тестам. Для этого:

Нажать кнопку More Options (8) В окне Samples – More Options нажать кнопку Define Groups

–  –  –

В появившемся окне Edit Group задать в поле Code: краткое обозначение теста, в поле Name: можно указать полное название.

Нажать кнопку OK.

Закрыть последовательно окна Define Groups и Samples – More Options.

В столбце Groups (9) выделить ячейки, соответствующие образцам, для которых была создана группа.

Нажать кнопку (10).

В появившемся окне Groups поставить флажок для выбранного теста.

Нажать кнопку OK.

Повторить все описанные в п. 3.7.5. действия для остальных проводимых в рамках сессии тестов.

4. ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

Детекция продуктов амплификации осуществляется прибором автоматически в каждом цикле амплификации.

На основании этих данных управляющая программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналов.

5. АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. По окончании амплификации нажать в главном окне кнопку Analysis (1).

5.2. В появившемся окне Analysis выбрать вкладку Quantitation (2), выделить надпись Cycling A. Green (3) и нажать кнопку Show (4).

5.3. В окне Analysis на вкладке Quantitation (2), выделить надпись Cycling A. Yellow (3) и нажать кнопку Show (4).

5.4. Закрыть окно Analysis.

В главном окне программы появится 6 окон:

5.5. Сделать активными в поле (1) все образцы, относящиеся к одному тесту.

5.6. Максимизировать окно Quantitation Analysis – Cycling A. Green кнопкой (2).

5.7. Установить следующие параметры обработки (см. рис.):

кнопка (5) – Log Scale;

кнопка Dynamic Tube (6) – нажата;

кнопка Slope Correct (7) – см. таблицу;

поле Eliminate Cycles before (10) – 10;

5.8. Нажать кнопку More Settings… (9) и в открывшемся окне Quantitate Settings установить следующие значения:

флажок Enabled в рамке Reaction Efficiency Threshold:

(14) – снят;

в поле % рамки NTC Threshold: – значение из таблицы, соответствующее выбранному каналу и тесту.

–  –  –

* - Типоспецифичные наборы ** - Наборы без дифференцировки типа.

Нажать кнопку OK (15)

5.9. Задать в поле Threshold (11) значение из таблицы, соответствующее выбранному каналу и тесту.

5.10. Вернуть окну обычный размер кнопкой (12).

5.11. Повторить п.п. 5.6.-5.10. для окна Quantitation Analysis – Cycling A. Yellow (3).

Примечание. Поскольку во всех тестах используется единая система внутреннего контроля, то настройки для канала Yellow задаются 1 раз за сессию.

5.12. Нажать на панели инструментов главного окна кнопку Reports (4).

5.13. В появившемся окне Report Browser следует выбрать тип обработки и канал, по которым будет создаваться отчет Quantitation\CyclingA.Green (16), а также тип отчета (17). Нажать кнопку Show (18).

5.14. Программа выведет окно Preview, в котором осуществляется просмотр отчета, а также все операции по его сохранению, экспорту в другие программы и печати. Отчет следует сохранить в наиболее удобном формате и, при необходимости, распечатать.

5.15. Закрыть окно Preview.

5.16. Повторить п.п. 5.13. – 5.15. для канала Yellow (19).

5.17. Закрыть окно Report Browser.

5.18. Повторить п.п. 5.5. - 5.10. и 5.12. – 5.18. для остальных тестов, проводившихся в рамках данной сессии.

5.19. Интерпретация результатов качественного анализа производится согласно таблице (значения конечных циклов КЦ для каждого возбудителя и внутреннего контроля приведены выше):

Интерпретация результатов:

В таблице использованы следующие обозначения:

Сt Green – цикл пересечения кривой накопления специфического флуоресцентного сигнала образца с пороговой линией;

Ct Yellow – цикл пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала внутреннего контроля образца с пороговой линией;

N/A – пересечение кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией не зарегистрировано;

КЦ – конечный цикл – пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией после него полностью аналогично ситуации, когда пересечение не зарегистрировано вовсе.

–  –  –

5.20. Интерпретация результатов количественного анализа (чувствительность наборов см. в основной части инструкции, КЦ для внутреннего контроля составляет 35 циклов):

Интерпретация результатов:

В таблице использованы следующие обозначения:

Сt Green – цикл пересечения кривой накопления специфического флуоресцентного сигнала образца с пороговой линией;

Ct Yellow – цикл пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала внутреннего контроля образца с пороговой линией;

N/A – пересечение кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией не зарегистрировано;

КЦ – конечный цикл – пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией после него полностью аналогично ситуации, когда пересечение не зарегистрировано вовсе.

–  –  –

Внимание! Надежными можно считать численные значения только для тех образцов, значения Ct для




Похожие работы:

«Алексей Васильевич Кушлак Формирование и обрезка плодового сада Серия "Библиотека журнала "Чернозёмочка"" http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=8909278 Алексей Кушлак. Формирование и обрезка плодового сада: ИД Социум; Воронеж; 2014 Аннотация Чтоб...»

«ЛАНДШАФТ ЧТО ТАКОЕ ФОРМОВЫЙ САД Всем хорошо знаком обычный плодовый сад с яблонями, грушами и кустарниками. Но можно создать такой сад, где плодовые деревья и кустарники имеют самую необычную форму – в виде низких борд...»

«Шрайбер Ангелина Николаевна ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ СОЦИАЛЬНОГО ИНСТИТУТА РОДИТЕЛЬСТВА В АЛТАЙСКОМ КРАЕ (по результатам социологических исследований 2009–2012 гг.) Специальность 22.00.04 — социальная структура, социальные институты и процессы Диссертация на соискание ученой степени кандидата соц...»

«Г. Ф. МОРОЗОВА Эмиграция — реальная угроза будущему страны Русская общественная жизнь последнего десятилетия XX века породила четвертую волну эмиграции (три наиболее значительные предшествующие волны эм...»

«Тамара Шмидт Крайон. Лунный календарь на 2015 год. Что и когда надо делать, чтобы жить счастливо Серия "Книги-календари (АСТ)" http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=8375100 Тамара Шмидт. Крайон. Лунный календарь, 2015. Что и когда надо делать, чтобы жить счастливо: АСТ; Моск...»

«C. Э. КРАПИВЕНСКИЙ, Н. А. ТЕЛЬНОВА ЕДИНСТВО ПРИРОДНОГО И СОЦИАЛЬНОГО БЫТИЯ ЧЕЛОВЕКА Природное бытие человека представляет собой единый субстантивный мир, вписанный в целостность природы и выражает естественную порождённость человека и его непосредственную связь и близость всему сущему. Оно определяется как первон...»

«ГЕОГРАФИЯ И ПРИРОДНЫЕ РЕСУРСЫ 2014 № 1 С. 100–106 УДК 911.2 (571.53) Ж. В. АТУТОВА Институт географии СО РАН, г. Иркутск РЕКОНСТРУКЦИЯ ЛАНДШАФТНОЙ СТРУКТУРЫ ЛЕНО-АНГАРСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ РУБЕЖА XIX–ХХ...»

«О.Э. Бессонова ИНТЕГРАЛЬНО-ИНСТИТУЦИОНАЛЬНАя ПАРАДИГМА ЦИвИЛИзАЦИОННОГО РАзвИТИя КАК НОвАя МЕТОДОЛОГИя ПОзНАНИя Предлагается интегрально-институциональная парадигма цивилизационного развития в качестве новой методологии познания. Эта парадигма по своим фундаментальным основаниям противо...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОЦИАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" УТВЕРЖДАЮ И.о. проректора по научной работ...»







 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.