WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |

«Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского Национальный исследовательский университет Всероссийская общественная организация ...»

-- [ Страница 3 ] --

Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева, Саранск, irina-latyuk@yandex.ru На современном этапе одним из наиболее серьезных стрессоров антропогенной природы, действующих на растения, являются тяжелые металлы (ТМ). Их возрастающая эмиссия в окружающую среду приводит к накоплению в почве, откуда они легко поступают в растения и далее транспортируются по пищевым цепям. В последние годы предположено участие активированных форм кислорода в стрессовых реакциях растений и их клеток при действии ТМ. В связи с этим необходимо детальное сравнительное изучение механизмов влияния ТМ на растения in vivo и культуру клеток in vitro.Биология клеток растений in vitro является важнейшим разделом клеточной биологии и физиологии растений. Культура клеток высших растений представляет собой хорошую модель для изучения молекулярных и клеточных механизмов устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам. Исследования проводились на 7-дневных проростках огурца сорта Единство и 5-недельной каллусной культуре, полученной на разных эксплантах. Каллусы пересаживали на среду МС с добавлением различных концентраций (от 10-5 до 10-3 М/л) CuSO45H2O. Растения выращивали в растильнях с таким же вариантом концентраций CuSO45H2O, как и для каллуса. В листьях растений и каллусной ткани определяли интенсивность перекисного окисления липидов и скорость генерации супероксидного анион-радикала (О2 ), а также активность супероксиддисмутазы (СОД), аскорбат-пероксидазы (АПО) и каталазы. При изучении зависимости скорости генерации супероксидного анион-радикала от содержания ионов Cu2+ в среде показано, что уровень образования этой АФК возрастал относительно контроля во всех вариантах опыта.



Очевидно, что все концентрации меди индуцируют в клетках растений огурца возникновение окислительного стресса; при этом высокая доза ионов меди (1 мМ) приводит к более сильному стрессу. В каллусной культуре обнаружено падение скорости генерации О2 относительно контроля. При изучении интенсивности ПОЛ в растениях огурца было установлено, что этот показатель при всех дозах ионов меди в среде возрастал относительно контроля почти линейно. При этом с увеличением дозы Cu2+ в среде интенсивность ПОЛ повышалась, достигая максимума при концентрации 0,1 мМ.

Интенсивность ПОЛ в каллусной культуре также понижалась относительно контроля во всех вариантах опыта относительно контроля. Активность каталазы в растениях увеличивалась линейно относительно концентрации Cu, в то время как в каллусе значения активности были ниже контроля при 100мкМ и 10мкМ, максимум, превышающий контроль был на концентрации 1мМ. Активность СОД в растениях достигала максимума при 100мкМ и 10мкМ. В каллусной культуре все показатели были ниже контроля. Активность АПО в растениях была практически одинакова во всех вариантах опыта. Однако в каллусе данные показатели оказались ниже контроля.

Исходя из этого, можно сказать, что каллусная культура более устойчива к тяжелым металлам по сравнению с проростками. Это может быть связано с отсутствием дальнего транспорта ионов меди, как это происходит в целом растении; отсутствием надклеточного уровня регуляции, на который не влияют ионы Cu2+; отсутствием тканей, избирательно поглощающих тяжелые металлы; а также может быть результатом адаптации на клеточном уровне к избыточным дозам тяжелых металлов в среде.

ВЛИЯНИЕ ТРИПТОФАНА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ СИНТЕЗА АУКСИНОВ

У ГРИБОВ-БИОДЕСТРУКТОРОВ TRICHODERMA VIRIDE И FUSARIUM MONILIFORME





–  –  –

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород, almele@ya.ru Способность синтезировать ауксины достаточно хорошо исследована в основном для видов и штаммов грибов, тесно взаимодействующих с растениями в качестве фитопатогенов или микоризообразователей, тогда как в отношении технофильных микромицетов имеются лишь единичные работы. В то же время исследование возможностей синтеза ауксинов грибами – биодеструкторами промышленных материалов представляет значительный интерес, так как фитогормоны способны повышать биосинтез некоторых ферментов, участвующих в биодеградации, а также изменять ростовые характеристики мицелия, важные для процессов деструкции.

Целью нашей работы являлось исследование влияния триптофана на интенсивность синтеза ауксинов у штаммов Trichoderma viride BKM F –1117 и Fusarium moniliforme ВКМ F – 136, применяемые для стандартных испытаний грибостойкости промышленных материалов. Грибы выращивали 2 недели в темноте на трех типах жидкой полной среды Чапека, различающихся концентрацией триптофана: 0 мМ, 0,5 мМ, 1,2 мМ. Культуральную жидкость отфильтровывали от мицелия. Определяли сырой вес мицелия. Из культуральной жидкости, рН

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

которой доводили до 3,0, двумя объемами этилацетата экстрагировали индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) и родственные ей соединения, химическую природу которых идентифицировали с помощью тонкослойной хроматографии. Суммарную этилацетатную фракцию замораживали (-200C, 12ч), отфильтровывали на холоде от кристаллов льда и выпаривали в роторном испарителе. Сухой остаток, растворенный в этаноле, использовали для количественного определения ИУК путем измерения на спектрофотометре при =535нм оптической плотности окрашенного в красноватый цвет продукта реакции ИУК с реактивом Сальковского. Концентрацию ИУК в среде роста выражали в мкМ, количество ИУК на единицу биомассы – в мкг на г сырой массы мицелия.

Ауксиновую активность выделенных соединений подтверждали с помощью биотеста на колеоптелях пшеницы.

Установлено, что оба штамма, выбранных для исследования, способны накапливать соединения, дающие с реактивом Сальковского красную окраску, что указывает на наличие ИУК в культуральной жидкости обоих грибов. В присутствии как меньшей, так и большей концентрации триптофана в среде роста интенсивность накопления ИУК у F. moniliforme возросла в 2,4 раза, однако у T. viride не претерпела достоверного увеличения.

В то же время было установлено, что указанные концентрации триптофана по-разному сказались на накоплении биомассы мицелия грибов. В частности, мицелиальная масса F. moniliforme на всех средах превышала массу мицелия T. viride не менее чем в 2,7 раза. Наиболее предпочтительной для продуцирования ИУК в расчете на единицу массы любого из двух грибов оказалась концентрация триптофана, равная 0,5 мМ, причем единица биомассы T. viride обладала большей ауксинпродуцирующей способностью, чем F. moniliforme при любой концентрации триптофана.

Таким образом, биодеструкторы T. viride и F. moniliformе способны синтезировать ауксины, при этом возрастание концентрации триптофана в среде роста значительно сильнее увеличивает накопление ИУК у F.

moniliformе. Тем самым ауксины способны оказывать модифицирующее действие на процессы биодеструкции материалов, особенно - имеющих в своем составе триптофан.

ЖИВЫЕ КЛЕТКИ В НЕОРГАНИЧЕСКИХ ОБОЛОЧКАХ: БИОИМИТИРУЮЩАЯ ИНКАПСУЛЯЦИЯ

–  –  –

Создание новых биосовместимых материалов является на сегодняшний день важной задачей для исследователей.

Одним из бурно развивающихся направлений является биомиметика. Биомиметика - это использование биологических объектов в качестве матриц и прототипов для создания различных материалов и искусственных биологических систем. С появлением этого направления внимание ученых обратилось на самый распространенный на планете минерал биологического происхождения – карбонат кальция.

Исследования процессов формирования биогенного карбоната кальция позволяют создавать новые биосовместимые материалы, совмещающие в себе свойства органических и неорганических веществ, а также приблизиться к открытию эволюционных механизмов формирования биогенных минералов.

В связи с этим целью данной работы явилось создание биоимитирующих оболочек карбоната кальция вокруг живых клеток микроорганизмов и водорослей.

В данной работе мы показали возможность создания искусственных микрокапсул из карбоната кальция для еденичных клеток микроорганизмов и водорослей. В качестве модельных объектов мы использовали клетки пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), конидии микроскопического гриба Trichoderma asperellum и одноклеточной зеленой водоросли Dunadiella martima.

С помощью метода флуоресцентной микроскопии было обнаружено, что инкапсулированные клетки остаются жизнеспособными в течение нескольких месяцев хранения. Для оценки жизнеспособности мы использовали окраску флуоресцеин диацетатом (ФДА-тест). Известно, что ФДА деацетилируется неспецифическими эстеразами внутри клеток, в результате чего образуется флуоресцирующий продукт. Также мы проверили жизнеспособность клеток, после удаления неорганических капсул, обработкой ЭДТА. ФДА тест показал, что инкапсуляция не нарушает клеточную стенку и ферментативную активность клеток.

Таким образом, была разработана методика инкапсуляции индивидуальных клеток микроорганизмов и водорослей в капсулы из карбоната кальция. Комбинация свойств живых клеток и неорганического карбоната кальция открывает широкие возможности в разработке новых материалов.

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ НА СОДЕРЖАНИЕ ОКСИДА АЗОТА В КОРНЯХ

ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

–  –  –

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

Учреждение российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, alenkina@ibppm.sgu.ru Исследователями молекулярных механизмов функционирования микробно-растительных ассоциаций ведется активный поиск рецепторных структур микро- и макропартнеров и изучение ответных реакций, возникающих при установлении ассоциативных взаимодействий. В ассоциации «пшеница-Azospirillum» большой интерес представляют бактериальные лектины в связи с их известными информационными функциями в различных биологических системах.

Ранее с поверхности клеток Azospirillum brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности Azospirillum brasilense Sp7.2.3 были выделены лектины, являющиеся гликопротеинами с молекулярной массой 36 кDa, проявляющие специфичность к L-фукозе и имеющие структурные и антигенные различия. Было показано, что лектины азоспирилл наряду с другими поверхностными структурами способны не только участвовать в адгезии бактерий на корнях растений, но и влиять на метаболизм растительной клетки - стимулировать прорастание семян, проявлять по отношению к растительной клетке митогенную и ферментмодифицирующую активности.

Оставался открытым вопрос, изменение метаболизма растительной клетки под действием лектинов азоспирилл происходит с участием NO-синтазной сигнальной системы или без нее. Ключевой молекулой NO-синтазной сигнальной системы является оксид азота (NO).

Показано, что лектины двух штаммов азоспирилл — A. brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности A.

brasilense Sp7.2.3 в концентрации 40 мкг/мл вызывают два пика индукции синтеза оксида азота в корнях проростков пшеницы, происходящей через 3 и 26 ч совместной инкубации. Различия между лектинами родительского и мутантного штаммов наблюдались лишь в случае 26 - часовой инкубации и лектин родительского штамма в большей степени активировал продукцию оксида азота в корнях. Добавление в среду инкубации корней с лектинами кальция в виде СаСl2(0,1мМ) приводило к снижению индуктивной активности обоих лектинов после 26 ч инкубации.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл способны активировать продукцию оксида азота, и тем самым выступать в качестве индукторов адаптационных процессов корней проростков пшеницы.

ЛИПИДЫ ТОНОПЛАСТА КОРНЕПЛОДОВ КРАСНОЙ СТОЛОВОЙ СВЁКЛЫ

ПРИ ГИПО- И ГИПЕРОСМОТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ

–  –  –

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, ozol@sifibr.irk.ru Проводилось изучение динамики липидной составляющей тонопласта при гиперосмотическом и гипоосмотическом стрессах. Изучались липиды выделенные из тонопласта и липиды выделенные из микродоменов (рафтов ) тонопласта. Результаты экспериментов по изучению жирнокислотного состава липидов тонопласта позволяют сделать вывод о том, что текучесть вакуолярных мембран, при гиперосмотическом стрессе, снижается по сравнению с нормой на 1,7%, а при гипоосмотическом стрессе увеличивается на 0,26%.

Липидный состав вакуолярных мембран при этом, по данным ТСХ, практически не изменялся. Изучение липидной составляющей рафтов тонопласта методами тонкослойной хроматографии показало преобладание гликолипидов и стеринов, что характерно для рафтов плазматической мембраны растений и рафтов, выделенных из мембран животных клеток. Идентификация полученных спектров продолжается. Будут приведены предварительные данные по изучению жирнокислотного состава липидной составляющей рафтов, выделенных из мембран корнеплодов, подвергнутых гипо- и гиперосмотическому стрессу, а также исследования, проведённые на корнеплодах, находящихся на разных фазах онтогенеза. Кроме того, будут доложены результаты изучения липидов микродоменов тонопласта методом ИК-спектроскопии.

СОДЕРЖАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ У РАЗЛИЧНЫХ

ВИДОВ ГОЛУБИКИ И ЧЕРНИКИ ПРИ ЦВЕТЕНИИ И ПЛОДОНОШЕНИИ

–  –  –

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород, pavlovaee@gmail.com

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

Голубика и черника относятся к роду Vaccinium. Род Vaccinium является источником витаминов и фенольных соединений (ФС), которые широко используются в качестве лекарственных средств и биологически активных добавок. В различные периоды вегетации в растениях изменяется уровень ФС и витаминов, поэтому выявление их содержания в зависимости от периода вегетации важно для определения времени сбора растительного материала.

Целью работы являлось сравнение количества фенольных соединений и аскорбиновой кислоты (АсК) у различных видов голубики и черники в периоды цветения и плодоношения. Объектами исследования служили листья растений голубики щитковой, узколистной и черноплодной, а так же черники кавказкой, культивируемые в Ботаническом саду ННГУ, и Г. обыкновенной и черники произрастающих в лесных массивах Нижегородской области. Определение суммы общих растворимых фенольных соединений (ОРФС), флавонолов (Фл), проводили в 80% этаноловой вытяжке из листьев.

Наибольшее количество ОРФС и Фл в листьях в период цветения определили у черники обыкновенной (122 и 92 мг/г сыр. в. соответственно). А наименьшее количество ОРФС и Фл – в Г. черноплодной (39 и 28 мг/г сыр. в.).

При этом Фл составляют 47-76% ОРФС при цветении растений. В период плодоношения максимальное содержание ОРФС оказалось у черники обыкновенной (135 мг/г сыр. в.), а также у Г. узколистной (132 мг/г сыр.

в.). Наибольшее количество Фл оказалось у Г. обыкновенной (104 мг/г сыр. в.), черники обыкновенной (103 мг/г сыр. в.) и Г. узколистной (99 мг/г сыр. в.). Наименьший же уровень ОРФС и Фл в период плодоношения оказался характерен для листьев Г. черноплодной (45 и 36 мг/г сыр. в. соответственно) и черники кавказской (37 и 36 мг/г сыр. в.).

Таким образом, в результате наших исследований выявлено, что большинство видов характеризуется возрастанием количества ОРФС (на 11-120%) и Фл (на 12-230%) в листьях в период плодоношения. Самое резкое увеличение уровня ФС обнаружено у Г. обыкновенной (количество ОРФС и Фл увеличилось более чем в 2 раза). Однако, по нашим данным, у черники кавказской количество ФС значительно снизилось. В основном за счет резкого снижения нефлаваноидной части ОРФС.

В оба вегетационных периода максимальное содержание АсК в листьях определили у Г. узколистной (2,1 мг/г сыр. в. Цв, 3,4 мг/г сыр. в. Пл) и щитковой (1,6 мг/г сыр. в. Цв, 3,6 мг/г сыр. в. Пл). Наименьшее же количество АсК содержалось в листьях Г. черноплодной(0,4 мг/г сыр. в. Цв, 0,7 мг/г сыр. в. Пл) и черники кавказской (0,2 мг/г сыр. в. Цв, 0,5 мг/г сыр. в. Пл).

Уровень АсК так же, как и уровень ФС, возрастает в период плодоношения. Однако количество АсК увеличивается более значительно, чем количество ФС, а именно на 60-132%, по сравнению с количеством АсК в период цветения, у всех исследуемых видов растений. Наибольший прирост обнаружен у черники кавказской (на 132%) и Г. щитковой (на 128%).

Таким образом, содержание фенольных соединений и аскорбиновой кислоты в листьях исследуемых растений значительно возрастает во время плодоношения (особенно уровень АсК). Это необходимо растению для защиты от вредителей в этот важный период вегетации, а также для накопления фенольных соединений и витаминов в ягодах. Растениями наиболее богатыми фенолами и аскорбатом являются голубика узколистная и черника обыкновенная. А наименее богата этими соединениями голубика черноплодная. Кроме того, было показано, что флаванолы составляют большую часть растворимых фенольных соединений.

ШТАММЫ RHODOCOCCUS, ОБЛАДАЮЩИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

–  –  –

Исследования в области биокатализа и биотрансформации являются одним из важнейших направлений современной биотехнологии. Амидазы – ферменты, катализирующие гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония. Известно, что у бактерий амидазная активность часто сопряжена с метаболизмом нитрилов.

У прокариот известны два пути метаболизма этих соединений:

двустадийный гидролиз, с помощью ферментов нитрилгидратаз и амидаз и одностадийный гидролиз, осуществляемый нитрилазой.

Бактерии, обладающие высокой амидазной активностью, представляют интерес для биокаталитического получения различных карбоновых кислот, в частности, могут быть использованы как биокатализаторы синтеза аммонийных солей акриловой и никотиновой кислот.

Цель настоящей работы – изучение бактерий, метаболизирующих амиды карбоновых кислот, выявление и секвенирование генов амидазы.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

В результате селекции из образцов почв нами выделено более 400 культур грамположительных бактерий, активно метаболизирующих амиды и нитрилы, из них 38, обладающих амидазной активностью более 5 мкмоль/мг/мин, значительно превышавшей нитрилгидратазную в широком интервале температур. Методами полифазной таксономии, а также путем анализа генов 16S рРНК изоляты идентифицированы как R. erythropolis, R. rhodochrous, R. ruber, Arthrobacter sp.

Показано, что большинство амидаз Rhodococcus высокоактивны при повышенной температуре (50°С), что важно для использования активной биомассы. Проведена трансформация нитрилов и амидов, включая алифатические, разветвленные, непредельные, гидроксилированные и ароматические амидов выделенными штаммами.

Установлено, что наилучшими субстратами для ферментов большинства штаммов являются ацетамид и пропионамид (наиболее простые по структуре и легко-метаболизируемые субстраты). Однако некоторые штаммы, селекционированные на изобутиронитриле и изобутирамиде предпочитали именно эти субстраты с пространственно затрудненным доступом к амидной группе. Никотинамид и бензамид гидролизовались с меньшей скоростью.

Методом ПЦР получены фрагменты ДНК штаммов Rhodococcus, родственные генам амидаз трех типов:

R.erythropolis (AY026386, Genbank), R. erythropolis (M88614, Genbank), Rhodococcus sp. N-771, R. rhodochrous J1.

Нуклеотидные последовательности определены с помощью ДНК-секвенирующей системы MegaBase1000.

Проведено сравнение нуклеотидных последовательностей и филогенетичский анализ.

Показано, что геномы изолятов Rhodococcus содержат преимущественно две группы последовательностей, родственные ранее известным генам амидаз R. erythropolis, GenBank E12517, R. rhodochrous J1, S38270 (I группа), и R. erythropolis, GenBank, M88614 (II группа).

Гены других амидаз встречались со значительно меньшей частотой. Установлено, что изолированные и секвенированные фрагменты гомологичны соответствующим последовательностям генов амидазы R. erythropolis (M88614, Genbank) на 93-99,2%, Rhodococcus sp. N-771 - на 83-98,7%, R. rhodochrous J1- на 95-99%. Большинство штаммов также содержали последовательности, родственные генам - и - субъединиц Fe-содержащей нитрилгидратаз, ранее известной у штаммов R. rhodochrous N-774, Rhodococcus sp. R312.

Филогенетический анализ секвенированных последовательностей показал, что большинство изучаемых последовательностей независимо выделенных штаммов из почв, взятых в географически различных точках, более близки между собой, чем к последовательности, депонированные в GenBank E12517, M88614. Вид получаемого филогенетического древа позволяет предположить, что структура вновь выявленных генов ближе к гипотетической предковой форме алифатической амидазы.

Работа поддержана программами: Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009–2010 годы)».

ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЕ БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ ИЗ

РАЙОНА РАЗРАБОТОК ВЕРХНЕКАМСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ СОЛЕЙ

–  –  –

В последние годы в результате промышленной деятельности человека увеличивается поступление в окружающую среду (моно)полиароматических углеводородов, которые обладают устойчивостью, токсичностью и представляют опасность для биосферы. Наиболее перспективным методом разложения данных соединений является микробная деструкция. В ряде случаев эффективность данного метода ограничивается экстремальными условиями среды, такими как высокое засоление, высокие или низкие значения pH среды.

Целью работы являлось выделение и исследование бактерий-деструкторов (моно)полиароматических углеводородов, устойчивых к экстремальным факторам среды.

Методом накопительных культур из образцов почвы, грунта и техногенно-минеральных образований района солеразработок (г. Соликамск, г. Березники, Пермский край) выделен 21 штамм бактерий-деструкторов ароматических углеводородов, отличающихся грампринадлежностью, морфологией колоний и клеток.

Установлено, что 13 выделенных штаммов способны к росту в минеральной среде Раймонда (Розанова, Назина,

1981) с нафталином, 6 штаммов - с орто-фталатом, 2 штамма – с бензоатом в качестве единственного источника углерода и энергии. Среди штаммов, растущих на орто-фталате, штамм КТ112 обладает наиболее широкой субстратной специфичностью и способен к росту на ароматических субстратах (нафталине, орто-фталате, бифениле) и продуктах их разложения. Грамотрицательные штаммы К513 и К511 способны к эффективному росту на бензоате (1 г/л) в среде, содержащей до 6% хлорида натрия. При содержании 3% NaCl данные штаммы растут на высоких концентрациях бензоата (5 г/л).

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

Большинство выделенных штаммов бактерий являются галоалкалотолерантными организмами, способными к росту в полноценной среде Раймонда при рН 8.0 и 7% NaCl.

Сравнительная генетическая характеристика грамположительных штаммов-деструкторов орто-фталата с использованием метода REP-ПЦР показала принадлежность данных культур к трем геномогруппам, а грамотрицательных штаммов-деструкторов бензоата - к одной геномогруппе.

Предварительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК показал, что штаммы-деструкторы бензоата К511 и К513 филогенетически близки к бактериям рода Pseudomonas (99%), штамм-деструктор бензоата К51 – к бактериям рода Bacillus (99,5%), штамм-деструктор бензоата К52 – к бактериям рода Virgibacillus (99,5%). Штамм-деструктор нафталина и орто-фталата КТ112 имеет наибольшее сходство с бактериями рода Rhodococcus (уровень сходства 98% с R. wratislavensis FPA1T).

Работа выполнена при поддержке Программой Президиума РАН ”Молекулярная и клеточная биология” (ГР в ЦИТиС №01200963682) и ФЦП ”Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” (ГК №02.74011.0078).

ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ ИНВЕРТАЗЫ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ ПО

КРОСС-АДАПТАЦИИ

–  –  –

Пермский государственный университет, Пермь, Chudinova.Lar@psu.ru Эксперименты по перекрестной адаптации являются убедительным доказательством функционирования общих механизмов устойчивости растений к действию различных стрессоров. В настоящее время основное внимание уделяется изучению биохимических и молекулярно-генетических аспектов устойчивости растений к неблагоприятным факторам, в частности, к одновременному действию высокой температуры и засоления.

Ключевым механизмом адаптации к стрессорам разной природы является синтез низкомолекулярных защитных соединений (НМП). К таким соединениям относятся моносахариды, аминокислоты, бетаины, полиамины. Они выполняют осмопротекторные и протекторные функции. Концентрация этих соединений будет зависеть от активности как индуцибельных, так и конститутивных ферментов их метаболизма. В этом аспекте данный вопрос исследован недостаточно. Целью нашей работы было изучение активности инвертазы (–Dфруктофуранозид-фруктогидролаза), регулирующей концентрацию моносахаридов, в условиях перекрестной адаптации проростков пшеницы к высокой температуре и засолению, а также влияние на этот процесс таких регуляторных соединений как кальций и путресцин. Исследования проводили на проростках пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Иргина. Растения выращивались в водной культуре при комнатной температуре в условиях естественного освещения. По достижении недельного возраста проростки пшеницы подвергали раздельному и совместному действию повреждающей температурой 45оС и засоления 0,5 %-ным NaCL. В соответствующих вариантах перед указанными воздействиями проводилась предварительная обработка проростков закаливающей температурой 37оС. Во второй и третьей серии опытные варианты выращивали в присутствии 0,015%-ного раствора Ca(NO3)2 и 5мМ путресцина соответственно. В листьях проростков определяли активность инвертазы по методу А.И. Ермакова и др. (1987). Полученные результаты показали значительное снижение активности инвертазы во всех опытных вариантах по сравнению с контролем. Особенно сильно активность фермента падала при совместном действии повреждающей температуры и засоления.

Введение ионов кальция и путресцина в питательную среду приводило к возрастанию активности инвертазы как в контрольных, так и в опытных растениях.. Причем опытные варианты сохраняли повышенный уровень активности этого фермента при всех стрессовых воздействиях. Можно предположить, что повышение в цитоплазме концентрации рядя вторичных мессенджеров (кальция и др.) изменяет экспрессию определенных генов, контролирующих накопление НМП и обеспечивает активацию кальций зависимых путей трансдукции сигнала в геном. Известно также, что полиамины принимают участие в индукции синтеза ферментов, причастных к образованию НМП. Повышение активность инвертазы может происходить и без участия белоксинтезирующей системы за счет разрушения под воздействием стрессоров комплекса “фермент – белокингибитор”. Увеличение активности гидролитических ферментов, таких как инвертаза, приводит к возрастанию количества моносахаридов. В литературе указывается на способность сахаров повышать стабильность биологических мембран, оказывать антиденатурационное действие на белки, проявлять антиоксидантные эффекты. Таким образом, можно сделать заключение, что установленное повышение активности инвертазы в экспериментах по перекрестной адаптации является неспецифической ответной реакцией растений на неблагоприятные воздействия различной природы.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕХАНИЗМА ЭКТОПАРАЗИТИЗМА НОВЫХ

УЛЬТРАМИКРОБАКТЕРИЙ РОДА CHRYSEOBACTERIUM НА БАКТЕРИЯХ РОДА BACILLUS

–  –  –

Пущинский государственный университет, Пущино, eritro@rambler.ru Нами были выделены из ила озера Байкал и многолетнего нефтешлама Нижнекамского нефтекомбината изоляты грамотрицательной бактерии – штаммы NF4 и NF5, представленные ультрамелкими коккоидными клетками и короткими палочками с размерами от 0.2 до 0.4 мкм в поперечнике и от 0.2 до 0.5 мкм в длину; среди них значительную часть (30- 60%) занимают наноформы - предельно мелкие клетки с диаметром 180- 300 нм и объемом 0.004-0.02 мкм3. На основании этих данных изолированные бактерии можно отнести к наиболее мелким ультрамикробактериям.

Клетки двух изученных изолятов - грамотрицательные, обладают хорошо выраженной наружной мембраной в клеточной стенке, неподвижные, не обладают жгутиками и скользящей подвижностью, размножаются делением с помощью перетяжки, почкованием и множественной септацией удлинённых клеток. Множественность путей репродукции обусловливает большой полиморфизм клеток.

Выделенные штаммы являются хемоорганотрофами, аэробами, психротолерантами, оксидазо- и каталазоположительными бактериями. Характерным признаком изолятов является отсутствие у него экзоклеточных деполимераз, таких как протеазы, липазы, пектиназы и целлюлазы.

По сходству в последовательности нуклеотидов в гене 16S рДНК и составу клеточных жирных кислот изоляты наиболее близки к некоторым видам рода Chryseobacterium (C. antarcticum, C. jeonii и C. marinum). Однако имеющиеся различия в нуклеотидных последовательностях гена 16S рДНК, а также в фенотипических признаках, таких как образование ультрамелких клеток, отсутствие ряда экзогидролаз, выраженный олиготрофизм и способность к эпибиозу на бактериальных клетках позволяют предполагать, что охарактеризованные изоляты являются, новым видом рода Chryseobacterium.

Особым свойством выделенных изолятов является их способность к эпибиозу – существованию в плотно прикрепленном состоянии на хозяйских клетках Bacillus subtilis. Этот процесс осуществляется поэтапно, конечной стадией является образование плотного контакта между взаимодействующими клетками.

Предполагается, что адгезия к хозяйским клеткам у штаммов NF4 и NF5(представителей филума Bacteroidetes) осуществляется тем же уникальным механизмом, который описан нами ранее у представителей альфапротеобактерий (Kaistia sp., штаммы NF1 и NF3). Ранее нами было описано наличие у данных штаммов рода Kaistia особых ловчих полисахаридных цепей, снабженных липкими узелками-гранулами, э функционируют в качестве улавливающих и стягивающих клетки канатов.

Работа выполнена при поддержке гранта Аналитической ведомственной целевой программы «Развития научного потенциала высшей школы» № 2.1.1/1187

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ БИОРАЗНООБРАЗИЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ВСТУПАЮЩИХ В СИМБИОЗ

С ЧИНОЙ ГМЕЛИНА (LATHYRUS GMELINI FRITSCHI)

–  –  –

Биологическая фиксация азота бобовыми растениями в симбиозе с клубеньковыми бактериями является важнейшим биологическим процессом, играющим большую роль в круговороте азота в природе и обогащающим почву связанным азотом. В настоящее время микросимбионты дикорастущих бобовых растений умеренного климата изучены мало. Одним из таких растений является чина Гмелина (Lathyrus gmelinii Fritsch), встречающаяся на территории Республики Башкортостан (РБ), которая была взята нами для исследования ее микросимбионтов.

Уникальность чины Гмелина заключается в том, что она является травянистым многолетним реликтовым растением ледникового периода с коротким корневищем, произрастающим на кислых почвах с богатым содержанием микроэлементов, особенно азота.

Для исследования симбионтов чины Гмелина произрастающей в Белорецком районе РБ были собраны клубеньки с корней данного растения. Клубеньки собирали в полиэтиленовые пакеты. Внутрь пакета предварительно помещали влажную вату для предотвращения высыхания собранных клубеньков. После этого, в лаборатории производилась их отмывка и стерилизация. Рассев клубеньковых бактерий производили следующим образом: верхушку клубеньков надрезали стерильной иглой от одноразовых шприцов. Затем другой

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

стерильной иглой забирали материал, делая соскоб со среза, и высевали на твердую питательную среду.

Бактерии выращивали в термостате при 28°С.

Для определения степени филогенетического родства был проведен ПДРФ (полиморфизм длин рестриктазных фрагментов) анализ гена 16S рРНК. Выбор именно этого гена обусловлен, прежде всего, доступностью огромных массивов данных о структуре генов 16S рРНК у самых разнообразных микроорганизмов. Таким образом, было выявлено, что полученные бактерии по схожести гена 16S РНК образуют две однородные группы.

Для детального и более точного анализа фрагменты генов 16S рРНК размером 1300 п.н. представителей обоих групп были секвенированы. Поиск сходных последовательностей в базе данных генов с помощью программы «Megablast», доступной на вебсайте NSBI (www.ncbi.nlm.nih.gov.), показал, что секвенированные фрагменты по последовательности гена 16S рРНК у обоих представителей близки, тем не менее, к бактериям рода Phyllobacterium.

ПОИСК НОВЫХ ЗАЩИТНЫХ ПЕПТИДОВ В ЗЕРНЕ ЗЛАКОВЫХ РАСТЕНИЙ

Рогожин Е.А.1, Одинцова Т.И.2, Смирнов А.Н.3, Егоров Ц.А.1, Гришин Е.В.1 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва, rea21@list.ru Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики имени Н.И.Вавилова РАН, Москва Российской государственный аграрный университет – Московская сельскохозяйственная академия имени К.А.Тимирязева, Москва Растения в ходе своей эволюции выработали целый арсенал высокоэффективных механизмов защиты от патогенных микроорганизмов. Растительный иммунитет представляет собой сложную многоступенчатую систему защиты, которая включает в себя как создание барьеров на пути проникновения инфекции путем укрепления клеточных стенок, так и образование в различных органах и тканях разнообразных соединений с антимикробными свойствами. К антимикробным соединениям, продуцируемым растениями, относятся фитоалексины и фитоантисипины, пищеварительные ферменты, белки и антимикробные пептиды (АМП). Среди белков растений, участвующих в защите от патогенов важнейшая роль принадлежит белкам, связанным с патогенезом (pathogenesis-related proteins, PR-белки). Примерами таких белков являются хитиназы и глюканазы, рибосомо-инактивирующие белки, лектины и антимикробные белки и пептиды. Семена растений, способные сохраняться в земле на протяжении несколько месяцев до начала прорастания, являются одним из основных источников антимикробных белков и пептидов. Детальное исследование этих соединений играет важнейшую роль в понимании системы конститутивного иммунитета растений. Цель настоящей работы состояла в выделении и структурно-функциональной характеристике новых АМП ряда культурных и сорных растений, относящихся к семейству Злаковые (Poaceae) – пшеницы Кихара (Triticum kiharae), колосняка песчаного (Leumus arenarius) и ежовника обыкновенного (Echinochloa crusgalli).

С использованием методов жидкостной хроматографии в сочетании с MALDI-MS-TOF масс-спектрометрией и ступенчатой деградации по Эдману из зерна вышеуказанных злаков были выделены и охарактеризованы 4 полипептида с новым цистеиновым мотивом: два гомологичных 10-цистеиновых пептида (из зерна Triticum kiharae и Leumus arenarius), названные WAMP и LAMP соответственно, а также два гомологичных АМП, образующих уникальный 4-цистеиной мотив (из зерна Echinochloa crusgalli), названные Ec-AMP1 и Ec-AMP2.

Для полученных полипептидов были определены молекулярные массы, а также полные первичные структуры.

Поиск гомологий по базам денных UniProt и TrEMBL с использованием алгоритма BLAST показал, что для 10цистеиновых пептидов злаков свойственна высокая степень гомологии с хитин-связывающим доменом, который характерен для семейства гевеин-подобных АМП пептидов растений, а также для PR-белков класса хитиназ.

Также показано, что оба 10-цистеиновых пептида обладают антифунгальной и антибактериальной активностью против широкого спектра фитопатогенных грибов и бактерий в диапазоне концентраций 5-30 мкг/мл. Таким образом, в зерне культурного растения – гексаплоидной пшеницы Кихара и дикорастущего злака – колосняка песчаного – были обнаружены высоко гомологичные полипептиды, которых можно отнести к представителям нового подсемейства гевеин-подобных АМП растений. Для вделенных из зерна ежовника двух полипептидов с уникальным 4-цистеиновым мотивом в результате поиска по базам данных UniProt и TrEMBL с использованием алгоритма BLAST была обнаружена низкая степень идентичности с описанным ранее из зерна кукурузы (Zea mays) АМП, названного MBP-1. Установлено, что замыкание дисульфидных связей между остатками цистеина в молекулах Ec-AMP1 и Ec-AMP2 происходит в положениях C1-C4, C2-C3; также методом кругового дихроизма был показано, что данные молекулы являются -спиральными, что характерно для большинства АМП растений.

В отличие от MBP-1 кукурузы данные пептиды проявляли избирательную антифунгальную активность по отношению к фитопатогенным грибам рода Fusarium, кроме того, они не способны к подавлению роста бактерий.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

ПИРОФОСФАТЗАВИСИМАЯ ФОСФОФРУКТОКИНАЗА И ЕЕ РОЛЬ В МЕТАБОЛИЗМЕ

ОБЛИГАТНЫХ МЕТАНОТРОФОВ

–  –  –

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, rozovaolga1@rambler.ru Клонированием гена pfр из облигатных метанотрофных бактерий галоалкалофильного Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (I тип) и термотолератного Methylococcus capsulatus Bath (Х тип), реализующих соответственно рибулозомонофосфатный (РМФ) путь или РМФ путь в сочетании с циклом Кальвина, получены электрофоретически гомогенные препараты рекомбинантной пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы (ПФК). В отличие от ПФК Mc. capsulatus Bath, являющейся гомодимером с молекулярной массой субъединицы 45 кДа, фермент Mm. alcaliphilum 20Z – гомотетрамер. Обнаружено, что ПФК Mc. capsulatus Bath наряду с фруктозо-6-фосфатом (Ф-6-Р) (Кm= 2,27 мМ) обратимо фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (С-7-Р) и рибулозо-5-фосфат, проявляя наиболее высокое сродство к С-7-Р (Кm = 0,03 мМ). Этот факт указывает на участие ПФК Mc. capsulatus Bath в реакциях пентозофосфатного пути, ведущих к регенерации рибулозо-5фосфата, общего интермедиата в РМФ пути и цикле Кальвина. Напротив, ПФК Mm. alcaliphilum 20Z имеет высокую активность с Ф-6-Р (Vmax = 577 Е/мг белка, Кm = 0,64 мМ) и фруктозо-1,6-бисфосфатом (Vmax = 805 Е/мг белка, Кm = 0,095 мМ) и низкую с С-7-Р (Vmax = 0,18 Е/мг белка, Кm = 1,01 мМ). Таким образом, у Mm.

alcaliphilum 20Z, не имеющего цикла Кальвина, ПФК неэффективна в реакциях восстановительного пентозофосфатного пути. Mm. alcaliphilum 20Z – галотолерант, синтезирующий в качестве осмопротектора сахарозу, что сопровождается образованием ФФн. В геноме данного метанотрофа присутствует ФБФ-аза, необратимо дефосфорилирующая ФБФ. Предположено, что одновременное функционирование ПФК и ФБФ-азы обеспечивает утилизацию ФФн, образующегося при синтезе сахарозы.

Отсутствие у Mc. capsulatus Bath ФБФ-азы коррелирует с неспособностью накапливать сахарозу. Впервые установлено, что ген pfр Mc. capsulatus Bath расположен в одном опероне с геном hpp, кодирующим предполагаемую Н+-пирофосфатазу V-типа. Подобная локализация генов pfp и hpp обнаружена в хромосомах ряда автотрофных бактерий. Возможно, ПФК этих бактерий участвует также в энергетическом метаболизме, поставляя пирофосфат для работы мембранной ФФн-азы, создающей протонный градиент при гидролизе пирофосфата. Таким образом, энергия фосфоангидридной связи ФФн может опосредованно участвовать в синтезе АТФ без участия дыхательной цепи.

Значительные отличия в кинетических параметрах ПФК двух метанотрофов, обусловленные различной метаболической ролью фермента, подтверждаются филогенетическим анализом, выявившим высокую степень их дивергенции (16% идентичности транслированных аминокислотных последовательностей). При этом, ПФК Mm. alcaliphilum 20Z является представителем подгруппы «Р» II группы фосфофруктокиназ и кластеризуется совместно с ПФК из хемоорганотрофов, тогда как ПФК Mc. capsulatus Bath наиболее близка с ферментами автотрофных бактерий, представляющих подгруппу “В2”.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (08-04-01484а, 09-04-92520-ИК_а, 10-04-01224а) и ГК (02.740.11.0296).

ПОЛУЧЕНИЕ СПИРТА ИЗ ЗЕРНОВОГО СЫРЬЯ С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ ИЗМЕЛЬЧЕНИЯ ПРИ

СОПРЯЖЕНИИ ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА И БРОЖЕНИЯ

–  –  –

Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева, Саранск, kistig2@mail.ru Развитие спиртовой промышленности неразрывно связано с применением методов, направленных на увеличение выхода спирта. К числу прогрессивных нововведений относятся применение непрерывных процессов в производстве, использование новых штаммов дрожжей. Это ведёт к совершенствованию организации и является мощным источником дальнейшего роста экономической эффективности производства.

Одним из перспективных методов является проведение совместного ферментативного гидролиза и брожения, что позволит ускорить и удешевить процесс производства спирта за счет сокращения стадии разваривания, охлаждения, осахаривания сусла. Ультратонкое измельчение сырья позволит разрушить клеточные стенки зерен крахмала и обеспечить доступность крахмала для действия амилолитических ферментов микробных препаратов.

В ходе работы был проведен ферментативный гидролиз, совмещенный с брожением зерновой смеси с различной степенью измельчения. Концентрации внесения ферментных препаратов были постоянны, степень измельчения зернового сырья варьировала в пределах от стандартной (около 1 мм) до ультраразмеров (менее 1 мкм).

Проведенные нами исследования показали, что введение ферментных препаратов в рекомендуемых концентрациях и одновременное сбраживание зерна со стандартной степенью измельчения приводит к

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

неполному осахариванию, выбраживанию и низкому выходу спирта с единицы сырья. Максимальный выход спирта наблюдался при сбраживании сусла из зерна с ультраизмельчением.

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА РОСТОВЫЕ ПАРАМЕТРЫ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ НА ФОНЕ

ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

–  –  –

Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева, Саранск, krissaz@rambler.ru Во всем мире загрязнение тяжелыми металлами представляет серьезную угрозу для окружающей среды и здоровья человека. Считается, что среди химических элементов тяжелые металлы (ТМ) являются наиболее токсичными. Многие растения обладают способностью аккумулировать ТМ в количествах, во много раз превышающих их содержание в почвах, и, как результат, являются основным источником их поступления в пищевые цепи. Известно, что загрязнение различных биотопов ТМ оказывает весьма токсичное действие на все биохимические и физиологические процессы у растений, отравляя растение и снижая урожайность сельскохозяйственных культур. Однако, реакция растений на действие экологических стрессоров может модифицироваться биологически активными веществами. Среди них особое место занимают аналоги фитогормонов и синтетические регуляторы роста (РР).

В работе исследовали эффективность действия синтетических регуляторов роста: 10 нМ тидиазурона (TDZ), 0,1 мкМ цитодефа и 10-6 % эпина на растения пшеницы (Triticum aestivum L.) на фоне физиологических (10 мкМ) и сублетальных (1 мМ) концентраций ионов Cu2+, Zn2+, Pb2+ или Ni2+. Опытные семена замачивали в растворах РР, контрольные – в дистиллированной воде в течение 8 ч. Опыт проводили в водной культуре при температуре 22С, 16-часовом световом дне и освещенности 2000 лк. Длину побегов и корней измеряли на 7 сутки.

Все исследованные ТМ ингибировали рост осевых органов пшеницы. Самыми токсичными оказались ионы Ni2+, наименее токсичными – ионы Cu2+ (при 10 мкМ Cu2+ отмечали стимуляцию роста корней и побегов молодых растений). Для всех исследованных ТМ ингибирующий эффект возрастал с повышением концентрации металла.

Во многих вариантах эксперимента РР стимулировали рост побегов (эпин – 10 мкМ ионов Ni2+, Pb2+ и Cu2+ и 1 мМ ионов Zn2+; цитодеф – 10 мкМ ионов Ni2+,Cu2+, Zn2+ и 1 мМ Pb2+ и Zn2+), а также корней опытных растений (эпин – при 10 мкМ Pb2+, Cu2+ и Zn2+; цитодеф – при 10 мкМ ионов Cu2+ и 1мМ ионов Zn2+ и Pb2+. Препарат TDZ был эффективен лишь на фоне 1 мМ ионов Cu2+, а также стимулировал рост корней на фоне 10 мкМ ионов Ni2+.

Корневые системы растений в первую очередь реагировали на изменение концентрации ТМ. По их реакции можно количественно судить о степени металлоустойчивости опытных растений. Для этого рассчитывали индекс толерантности (ИТ) Уилкинсона (ИТ = длина корня в опыте/ длина корня в контроле). ИТ проростков возрастал при обработке TDZ на фоне 10 мкМ ионов всех изученных ТМ; при обработке цитодефом – на фоне 1 мМ ионов Pb2+ и 1 мМ и 10 мкМ ионов Zn2+; в вариантах с эпином – на фоне физиологических концентраций ионов Pb2+, Cu2+ и Zn2+.

Показано ингибирующее действие ионов ТМ на рост осевых органов проростков пшеницы. Выявлены физиологические различия по действию синтетических РР на растения пшеницы в условиях повышенной концентрации ТМ. Наиболее сильный рост-стимулирующий эффект отмечен при обработке семян эпином, наименее эффективным оказался тидиазурон. Показана эффективность применения эпина для стимулирования роста пшеницы при слабом загрязнении, а цитодефа – при сильном загрязнении ТМ.

ДЫХАТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ СТАБИЛЬНОСТИ

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ

–  –  –

Важными характеристиками иммобилизованных на поверхности носителя микробных клеток являются их жизнеспособность и метаболическая активность, поскольку от данных факторов зависит скорость процесса и количество деградируемого или синтезируемого продукта. Цель настоящей работы – определение дыхательной активности иммобилизованных на хвойных опилках актинобактерий рода Rhodococcus, используемых для биодеградации нефтяных углеводородов в лабораторном колоночном биореакторе.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

В работе использовали штаммы Rhodococcus ruber ИЭГМ 615 и Rhodococcus opacus ИЭГМ 249 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol). Процесс иммобилизации клеток родококков проводили в лабораторном колоночном биореакторе, представляющем собой стеклянную колонку (12,0 х 1,4 см), заполненную гидрофобизованными опилками (2 г). Колонка соединялась при помощи силиконовых трубок с колбой, содержащей суспензию (2,0 x 107 кл/мл; 200 мл) клеток R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249, отобранных в равном соотношении. Процесс биодеградации нефтяных углеводородов иммобилизованными клетками родококков в биореакторе изучали с использованием 2%-ной эмульсии модельной нефти (н-декан, н-ундекан, н-додекан, н-тетрадекан, н-гексадекан, н-гептадекан, ннонадекан – по 12%, пристан – 6%, нафталин, аценафтен, фенантрен, антрацен – по 2%), стабилизованной 0,1%ным р-ом Твина 60. Эмульсию подвергали УЗ-обработке частотой 24 кГц в течение 1 мин и пропускали через колонку. Каталитическую активность иммобилизованных клеток R. ruber и R. opacus изучали с помощью 6канального респирометра Micro-Oxymax® (Columbus, США) до и после цикла биодеградации нефтяных углеводородов в биореакторе. Оценивали скорость дыхания (мкл/мин), а также количество потребленного кислорода и выделенного углекислого газа (мкл) иммобилизованными клетками родококков и неинокулированным носителем (контролем) в присутствии модельной нефти. Измерения респираторной активности проводили при 22±2оС, интервал между измерениями составлял 0,42 ч.

В результате проведенных респирометрических исследований установлено, что родококки в иммобилизованном состоянии характеризуются стабильно высокой дыхательной активностью в присутствии модельной нефти. Так, количество потребленного кислорода и выделенного углекислого газа иммобилизованными клетками R. ruber и R. opacus равномерно увеличивается на протяжении 460 часов, в результате чего к концу эксперимента количество потребленного кислорода – в 5 раз, а выделенного углекислого газа – в 20 раз превышает контрольные показатели. Кроме того, для иммобилизованных клеток родококков характерна высокая скорость клеточного дыхания (удельная скорость потребления кислорода составляет 0,7, а выделения углекислого газа мкл/мин·мг сухих клеток), которая увеличивается в два раза после операционного цикла в биореакторе.

Повышенная дыхательная активность иммобилизованных клеток коррелирует с высокой (77%) степенью биодеградации нефтяных углеводородов. Таким образом, клетки алканотрофных родококков в иммобилизованном состоянии характеризуются высокой функциональной стабильностью, что важно при их использовании в биотехнологическом процессе очистки нефтезагрязненной воды.

СИМБИОЗ РАСТЕНИЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ

ПРИ ФИТОБИОРЕМЕДИАЦИИ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ТЕРРИТОРИЙ

–  –  –

Фитобиоремедиация предполагает удаление поллютантов из почвы, поверхностных и подземных вод при помощи растений и микроорганизмов. Проведена параллель и отмечена специфика детоксикационных возможностей растений и микроорганизмов, поскольку их совместное действие часто носит симбиотический характер. Органические токсиканты усваиваются и ассимилируются, т.е. подвергаются метаболической деградации. В этом процессе микроорганизмы следует признать более активными "детоксикационными агентами", чем растения, ввиду их быстрого роста, характерных им сравнительно легко саморегулируемых адаптационных и индуктивных процессов, а также широкого спектра генетической информации. Другая картина складывается в случае с неорганическими токсикантами, которые, проникнув в организм, не подвергаются метаболическим превращениям. В ряде случаев микроорганизмы разных таксономических групп способны аккумулировать внутри клетки довольно высокие концентрации тяжелых металлов, которые в результате лизиса клеточных стенок вновь оказываются в почве, что, в конечном счете, не способствует ее ремедиации.

Однолетние и многолетние растения довольно часто, обладая способностью усваивать вместе с другими питательными компонентами и токсиканты, транспортируют их в надземные органы, очищая, таким образом, как почву, так и водоемы. В качестве фиторемедиаторов хорошо зарекомендовали себя подсолнечник и водный гиацинт (Eichhornia crassipes). С целью создания научно-технических основ фитобиоремедиации загрязненных территорий в настоящей работе установлены экофизиологические характеристики растений подсолнечника и эйхорнии и бактерий родов Pseudomonas и Alcaligenes в отношении фосфор- и мышьяксодержащих поллютантов. Актуальность работы определяется необходимостью санации загрязненных территорий в районах хранения и уничтожения химического оружия. Предлагается новая стратегия решения проблемы фитобиоремедиации загрязненных почв. Достижение максимальной степени очистки заключается в создания трехступенчатой системы: на первой стадии ("ризосферная биодеградация") в загрязненную почву вносят специально подобранные для этих целей непатогенные ризосферные микроорганизмы (Alcaligenes и

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

Pseudomonas), которые в околокорневой системе осуществляют начальную трансформацию поллютантов, превращая их в менее токсичные, более гидрофильные соединения, значительно легче усваиваемые растениями.

На этой стадий будут также использованы органические соединения, не только ускоряющие разложение токсичных химикатов в почве, но и активирующие метаболические процессы, и тем самым, усиливающие ремедиационную активность растений; на второй стадии ("фитоэкстракция и фитотрансформация") растения, имеющие высокий ремедиационный потенциал, удаляют продукты биодеградации из загрязненного объекта; на третьей стадии ("озоление") остатки растений после фитобиоремедиации уничтожают на специально сконструированной установке с последующим захоронением золы. Таким образом, результаты исследования позволяют создать научно обоснованную стратегию регуляции экофизиологических характеристик растений и микроорганизмов для максимального выявления их фитобиоремедиационного потенциала и получить новую комплексную экологическую биотехнологию, направленную на охрану и оздоровление почв в районах хранения и уничтожения химического оружия.

ИММОБИЛИЗАЦИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ЛАКТОБАЦИЛЛ:

ВЛИЯНИЕ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ

–  –  –

Казанский государственный университет, г. Казань, yadinka@mail.ru Частота распространения микроэкологического дисбаланса (дисбактериозов) у россиян превышает 90% и имеет тенденцию к постоянному увеличению. Одним из приемов коррекции микробной экологии человека и животных, нашедшим наибольшую практическую реализацию сегодня, является применение пробиотиков бактериальных препаратов, которые при употреблении в адекватных количествах вызывают улучшение здоровья макроорганизма. Лечебная эффективность пробиотиков во многом зависит от успешной колонизации желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) входящими в их состав бактериями, которая, в свою очередь, определяется состоянием микроорганизмов после прохождения ими верхних отделов ЖКТ. В связи с вышесказанным актуальной становится оптимизация систем направленной доставки препаратов до сайтов их функциональной активности в макроорганизме.

В настоящей работе рассмотрена возможность использования растворимого картофельного крахмала и продукта ферментативного гидролиза крахмала мальтодекстрина в качестве носителя для пробиотических бактерий Lactobacillus plantarum 8P-A3. Для приготовления препаратов применяли лиофилизацию. Иммобилизацию бактерий в углеводной матрице оценивали с помощью световой микроскопии. Жизнеспособность иммобилизованных лактобацилл определяли классическими методами микробиологии (высев на чашки Петри и подсчет колоний), а также методом дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток (LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit) с последующей флуоресцентной микроскопией. В опытах in vitro проанализировали также эффекты желчи и желудочного сока на жизнеспособность лактобацилл в течение шести часов (средняя продолжительность полного переваривания пищи).

Мы показали, что бактерии L. plantarum 8P-A3 сохраняют высокую жизнеспособность в составе сорбентов в течение всего времени анализа - полугода. Протестированные носители не защищают лактобациллы от губительного действия соляной кислоты желудочного сока. Через два часа воздействия наблюдали полную гибель бактерий. Желчь также существенно снижает жизнеспособность лактобацилл уже через два часа воздействия. Зависимости губительного действия желчи от времени воздействия выявлено не было.

Представленные результаты демонстрируют возможность иммобилизации бактерий L. plantarum 8P-A3 в полисахаридной матрице из растворимого картофельного крахмала и мальтодекстрина, а также обосновывают необходимость помещения препарата в кишечнорастворимую капсулу. В целом, проведенные исследования открывают перспективы тестирования in vivo рассмотренных подходов повышения эффективности пробиотиков.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты №09-04-97032) и «Михаил Ломоносов» DAAD и Министерства образования и науки РФ (А/06/91824; A/08/72787). Авторы выражают благодарность К.Бойерляйну (Институт фармакологии им. Рудольфа Буххайма, г. Гиссен, Германия) за помощь в проведении флуоресцентной микроскопии и В.И.Лозинскому (Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН) за помощь в приготовлении препаратов иммобилизованных лактобацилл для анализа.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

ОЦЕНКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ШТАММОВ BACILLUS OLIGONITROPHILUS С ПОТЕНЦИАЛЬНО

ВЫСОКИМ ПРОТИВОРАКОВЫМ ДЕЙСТВИЕМ.

–  –  –

Обитающие в почве силикатные бактерии очень широко распространены в окружающей среде. Эти микроорганизмы не только разрушают алюмосиликаты с образованием доступных для растения форм калия и кремния, но и продуцируют биомассу, содержащую высокопитательные белки (включая все незаменимые аминокислоты), углеводы, широкий набор витаминов, ферменты и микроэлементы.

В последние годы возрастает интерес к силикатным бактериям, в частности к Bacillus oligonitrophilus. Это вполне оправдано, так как обнаруживаются «новые способности», которые могут найти применение в практической деятельности.

На нашей кафедре был установлен гипосенсибилизирующий эффект силикатных бактерий при их обработке бактериальными препаратами в процессе роста и развития. Подача легкоусвояемого кремния микробамиактиваторами, каковыми являются силикатные бактерии, вкупе с увеличением их количества в почве, и создания для растений условий, близких к оптимальным, ведет к резкому снижению стресса и, соответственно, падению концентраций аллергенов в тканях растения до величин ниже пороговых (вызывающих аллергическую реакцию).

Еще одним аспектом применения силикатных бактерий (в частности Bacillus oligonitrophilus) является их противораковый эффект. Неплохой эффект приёма культуры силикатных бактерий, по всей вероятности, связан, во-первых, с «гиперсиликозом» клеток, проходящих ювенилизацию генома (раковых клеток) и, соответственно, их избирательной гибелью вследствие нарушения ювенилизации, и, во-вторых, с некоторым усилением жизнеспособности организма больных за счёт усиления систем витаукта усвояемым кремнием. В связи со всем вышесказанным, ясен не ослабевающий интерес к силикатным бактериям, к их всестороннему исследованию.

Поэтому имеет определенное значение разработка быстрых и точных методов выделения штаммов силикатных бактерий из окружающей среды с их последующей оценкой.

В данной работе мы попытались оценить эффективность выделения штаммов силикатных бактерий на среде Александрова, используя феномен интеграции у этих бактерий, на среде Гисса-маннит с бромкрезоловым пурпурным, и на среде Гисса-манит с водно-голубым.

Искомые штаммы Bacillus oligonitrophilus с потенциально высокой противораковой активностью имеют следующие характеристики: развитие и длительное сохранение синей окраски биомассы и среды вокруг биомассы на среде Гисса-маннитом с водно-голубым; разрушение минералов среды Александрова и образование структур на ней типа колец – полуколец; определенные параметры суспензионного роста штаммов на жидкой среде Александрова (хороший рост, возможное газообразование, рН 5,0).

В общем итоге были исследованы 10 проб из различных мест. Опробованы новые методы выделения и проведена их последующая оценка. По совокупности данных, из проб удалось выделить штаммы Bacillus oligonitrophilus с потенциально высокой противораковой активностью из различных регионов. Выделенные штаммы были сопоставлены со штаммом Zc, который является стандартным штаммом Bacillus oligonitrophilus.

МИКРОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СОСТАВЕ БИНАРНЫХ БИОПЛЕНОК

–  –  –

Большинство микроорганизмов в природных местах обитания существуют в виде «биопленок» («biofilms») пространственно и метаболически структурированных сообществ, заключенных во внеклеточный полимерный матрикс и расположенных на границе раздела фаз. Такая форма существования предоставляет ряд преимуществ.

Известно, что многие процессы (например, утилизация некоторых субстатов) более активно осуществляются именно сообществом микроорганизмов, а не его отдельными членами. Такая повышенная активность биопленочного сообщества объясняется взаимодействиями, возникающими между его микробными компонентами. Нами было осуществлено моделирование биопленок, реконструированных из пластовых вод следующих месторождений: Даган (КНР) со слабой степенью минерализации и Ромашкинское нефтяное месторождение (республика Татарстан), содержание солей в котором достигает 100 г/л. Удалось показать, что между микробными компонентами ассоциаций, реконструированных из пластовых вод нефтяного месторождения со слабой степенью минерализации, существуют протокооперативные (взаимовыгодные) взаимоотношения, выражающиеся в следующем: не способный к окислению парафинов спутник использует

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

образуемые нефтеокислителем продукты окисления парафинов и синтезирует активаторы, стимулирующие процесс утилизации углеводородов нефтеокислителем. Было показано, что между галотолерантным нефтеокисляющим микроорганизмом (Dietzia sp.) и его галофильным спутником (Chromohalobacter sp.), выделенными из Ромашкинского нефтяного месторождения, в составе бинарной биопленки также устанавливаются протокооперативные взаимоотношения: галофильный спутник выполняет защитную функцию, выделяя в окружающую среду избыток образуемого им осмопротекторного вещества, которое поглощается галотолерантным нефтеокислителем и позволяет нефтеокислителю в составе биопленки выживать при тех концентрациях соли, которые в суспензионный монокультуре являются для него летальными; в свою очередь, галотолерантный нефтеокислитель снабжает неспособный к окислению парафинов галофильный спутник продуктами окисления нефти. Таким образом, раскрыта одна из возможных причин возникновения распространенных в природных условиях ассоциаций галофильных (способных к синтезу и экскреции осмопротекторных веществ) и галотолерантных микроорганизмов, поглощающих эти вещества из внешней среды. Известно, что микроорганизмы в составе биопленок обладают повышенной устойчивостью к воздействию биоцидов и других стрессовых факторов, что позволяет им переживать неблагоприятные условия среды. Нами была обнаружена устойчивость монобиопленок нефтеокислителя (Dietzia sp.) к тепловому воздействию при супраоптимальных температурах (37-500С), которая не наблюдалась для суспензионной культуры Dietzia sp.

Полученные результаты позволяют предполагать, что в случае биотехнологического использования нефтеокисляющих микроорганизмов (для биоаугментации природных субстратов: воды, почвы и др.) целесообразно использовать не только смеси нефтеокислителей, но и микроорганизмы спутники, повышающие активность нефтеокислителей и/или защищающие последние от стрессовых факторов. Изучение устойчивости как моно-, так и поливидовых биопленок может способствовать повышению эффективности биотехнологичнских процессов с использованием биопленок, а также разработке методов борьбы с биопленками в тех случаях, когда их наличие нежелательно (биокоррозия, биообрастания).

МЕМБРАНОТРОПНЫЙ ЭФФЕКТ 7-ДЕГИДРОХОЛЕСТЕРИНА НА КОРНИ ПШЕНИЦЫ

–  –  –

Казанский государственный университет, Казань, albinusik_89@mail.ru Стерины и их производные являются важными компонентами биологических мембран, оказывающими упорядочивающее воздействие на их структуру. Важной особенностью стеринов является высокое сродство к сфинголипидам, что способствует образованию ими липидных микродоменов для локализации сигнальных комплексов. Отличительной чертой современного этапа исследования стеринов является значительное возрастание интереса к биологической активности оксистеринов, которые являются дегидрированными предшественниками холестерина, а также могут образовываться в результате его окислительных трансформаций.

Холестерин является не только основным стерином животной клетки, но и входит в состав сложной стериновой смеси растительных клеток. Исследование биологических эффектов оксистеринов проводится, в основном, на модельных мембранах и мембранах животного происхождения. Информация о растительных оксистеринах и их роли в метаболизме растительных клеток практически отсутствует. В связи с этим, изучение воздействия оксипроизводных холестерина на жизнедеятельность растительных клеток представляется актуальным. Целью настоящей работы явилось изучение влияния 7-дегидрохолестерина на физиологические характеристики клеток корней пшеницы Triticum aestivum L., а именно интенсивность дыхания, проницаемость плазмалеммы для протонов и ионов калия, содержание супероксидного анион радикала. Было показано, что инкубация корней с 0,1 мМ 7-дегидрохолестерином индуцирует увеличение выхода из корней ионов калия и подщелачивание инкубационной среды, а также стимулирует скорость потребления корнями кислорода. Наблюдающиеся сдвиги К+/Н+ обмена могут приводить к подкислению внутриклеточного содержимого и последующей активации Н+АТФазы плазмалеммы для восстановления нарушенного ионного гомеостаза. Можно полагать, что рост энергозатрат для функционирования Н+-АТФазы компенсируется путем усиления интенсивности дыхания, которое мы наблюдаем в наших экспериментах. Мембранотропные свойства 7-дегидрохолестерина проявились также и в усилении образования супероксида на поверхности клеток корней. Известно, что при повышении уровня супероксида индуцируется перекисное окисление липидов, что также способствует увеличению проницаемости плазмалеммы для ионов. Совокупность наблюдаемых нами изменений может свидетельствовать о том, что 7-дегидрохолестерин оказывает на клетки корней заметный мембранотропный эффект, что может привести к потере целостности плазмалеммы и нарушению формирования и функциональной активности липидных микродоменов и мембраны в целом.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE 54,

ВЫРАЩЕННЫХ НА СРЕДАХ С РАЗНЫМИ ИСТОЧНИКАМИ АЗОТА

–  –  –

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, surkina-ak@mail.ru Диазотрофные ризобактерии рода Azospirillum способны вступать в ассоциации с широким кругом растений.

Эффективность таких ассоциаций определяется способностью бактерий прикрепляться к поверхности корня.

Важная роль в этом процессе принадлежит гликополимерам поверхности микроорганизмов, которые вовлечены в коммуникацию и адаптацию бактерий к существованию в разных экологических нишах, в которых необходимые азоспириллам источники азота и углерода определяются составом корневых экссудатов.

Существуют данные о вариабельности моносахаридного состава полисахаридов поверхности азоспирилл в зависимости от соотношения источников азота и углерода. Целью нашей работы было изучение влияния характера источника азота в среде на биополимерный и моносахаридный составы гликополимеров бактерий A.

brasilense 54, выделенных сотрудниками института сельскохозяйственной микробиологии УААН из параклубеньков шелковицы белой.

Бактерии культивировали до окончания экспоненциальной фазы роста на жидкой малатной среде с KNO3 (2,5 г/л) и NH4Cl(2,5 г/л), как наиболее часто используемыми источниками азота при выращивании азоспирилл. С поверхности клеток 0,5М раствором NaCl смывали капсулу, из которой с помощью гель-фильтрации на Sepharose CL-4B получали липополисахарид-белковый комплекс (ЛПБК54). Липополисахариды (ЛПС54) были выделены водно-фенольной экстракцией из наружной мембраны сухих бескапсульных клеток. Методом двойной радиальной иммунодиффузии с использованием кроличьих антител на ЛПС азоспирилл разных серогрупп, полученных ранее в работе Конновой с соавт. (2008), в составе исследуемых ЛПС было показано наличие антигенных детерминант, общих с ЛПС бактерий A. brasilense Sp7 (типовой штамм), отнесенных к серогруппе II.

Исследование биополимерного состава препаратов показало, что при добавлении в среду KNO3 содержание углеводов в ЛПС54 составило 72,0%, а в ЛПБК54 - 34,4%, в то время как для ЛПС54 и ЛПБК54 бактерий, выращенных в присутствии NH4Cl, эти значения были равны 24,6% и 59,4% соответственно. Полученные результаты соотносятся с данными электрофоретического исследования препаратов – в ЛПС бактерий, выращенных на среде с KNO3, концентрация малоподвижных молекул оказалась значительно выше, чем в ЛПС бактерий, выросших на среде c NH4Cl. С помощью метода хроматографии на бумаге и ГЖХ ацетатов полиолов в составе О-специфического полисахарида ЛПС54 в обоих случаях были обнаружены рамноза, глюкоза и неидентифицированный аминосахарид в соотношении 5,6:1,7:1. Анализ состава жирных кислот (ЖК) ЛПС54 методом ГЖХ показал присутствие тридекановой (С13:0), тригидроксидекановой (3-ОН-С14:0), гексадеценовой (С16:1), гексадекановой (С16:0), 3-гидроксигексадекановой (3-ОН-С16:0), октадеценовой (С18:1) и нанодекановой (С19:0) ЖК, при этом их соотношение в препаратах варьировало незначительно. Зависимости между соотношением ЖК в гликополимерах и содержанием определенного источника азота в среде культивирования не наблюдалось.

Таким образом, установлено, что характер источника азота не влияет на качественный моносахаридный состав и соотношение моносахаридов в полисахаридной части молекулы ЛПС, а изменяется только макромолекулярная организация, связанная с возрастанием длины цепи О-специфического полисахарида при выращивании бактерий на среде с KNO3.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 08-04-00669)

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ СПИРОХЕТ

В КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЕ ЛОСОСЕВИДНЫХ РЫБ

В ВОДОЕМАХ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ

–  –  –

Spirochaetes – это обособленная филогенетическая линия в пределах домена Bacteria, представители которой являются свободноживущими или паразитическими спиральными бактериями, некоторые из них относятся к патогенам человека и животных. В настоящее время систематика этой группы нуждается в ревизии, предполагают, что разнообразие некультивируемых Spirochaetes значительно больше, чем уже известных.

Молекулярно-генетический анализ нормальной микрофлоры термитов, некоторых видов рыб и моллюсков выявил последовательности спирохет, образующие на филогенетических дендрограммах самостоятельные кластеры. Микроскопическими исследованиями подтверждено наличие спиралевидных бактерий в заднем отделе

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

кишечника у рыб, в среднем отделе – у термитов и в кристаллическом стебельке у моллюсков. Предполагают, что спирохеты в среднем отделе кишечника термитов способствуют H2/CO2-ацетогенезу и азотфиксации, тем самым участвуют в деградации наиболее распространенных форм биомассы на Земле (лигноцеллюлозные растительные материалы). Цель работы – изучить генетическое разнообразие и распространение некультивируемых спирохет в кишечной микрофлоре лососевидных рыб в водоемах Восточной Сибири.

Материалом для работы послужили представители рода хариусовых (Thymallus), отобранные из разных мест обитания: р. Ангара и оз. Байкал (Байкальский бассейн), оз. Хойто-Гол (Восточные Саяны), р. Чечуй (бассейн р.

Лена) и аквариумной экспозиции Байкальского музея ИНЦ СО РАН. Для исследования кишечной микрофлоры рыб использовали разные методы выделения ДНК: наборы РИБО-Сорб и ДНК-Сорб (АмплиСенс, Москва), фенол-хлороформную экстракцию и модифицированную очистку с цетавлоном. Суммарную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции на парах праймеров как консервативных бактериальных, так и специфичных на филогенетическую линию Спирохеты. Для проведения микроскопических исследований брали соскобы внутренней слизистой оболочки свежесобранных фрагментов кишечника рыб. Препараты окрашивали по Романовскому-Гимза и определяли микроорганизмы по морфологическим характеристикам с помощью световой микроскопии. По результатам молекулярно-генетических исследований получено 23 последовательности, имеющих гомологию с представителями филогенетической линии Спирохеты.

Последовательности спирохет выявлены как с помощью консервативных бактериальных (из кишечников рыб, обитающих в р. Ангара и оз. Хойто-Гол), так и групп-специфичных праймеров (р. Чечуй). Филогенетический анализ всех последовательностей, выявил два различных генотипа. Последовательности первого генотипа, полученные из рыб Восточных Саян, образуют общий кластер с последовательностями типового штамма Spironema culicis (AF166259) и с некультивируемой спирохеты (EU681983), выделенной из кишечника теплокровных организмов. Последовательности второго генотипа, полученные из рыб Байкальского и Ленского бассейнов, образуют кластер с последовательностями типового штамма Brevinema andersonii (L31543) и некультивируемых спирохет, выделенных из кишечников различных видов рыб Америки, Японии и Китая.

Микроскопическими методами подтверждено наличие спиралевидных форм бактерий в заднем отделе кишечника черного байкальского хариуса из р. Ангара.

Работа выполнена в рамках программы РАН № 23, подпрограммы 1, проект 23.13.

–  –  –

В большинстве регионов мира подсолнечник (Helianthus annuus) выращивают как гибридную культуру с получением семян на основе цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) типа РЕТ1. Структурные изменения, связанные с абортивным развитием микроспор у линий с ЦМС РЕТ1 по хорошо изучены. В частности, описаны нарушения структуры мембранных органелл микроспороцитов, разрастание клеток тапетума и дегенерация микроспор. В коллекции ВНИИР им. Н.И. Вавилова имеется уникальная линия ВИР 109, представленная тремя аналогами: фертильным, ЦМС известного типа РЕТ1 и нового - RIG0 (на основе цитоплазмы однолетнего дикорастущего вида H. rigidus), перспективного для использования в гибридной селекции. Такая модель удобна для сравнительного анализа процессов микроспорогенеза ЦМС и фертильных форм. В связи с этим, целью работы явилось исследование с помощью световой и электронной микроскопии особенностей микроспорогенеза у ЦМС RIG0 растений подсолнечника. Фертильный и ЦМС РЕТ1 аналоги были взяты в качестве контроля. Материалом исследования служили пыльники фертильных и аналогичных стерильных растений линии ВИР 109 на двух стадиях развития: начальной (стадия спорогенных клеток и микроспороцитов) и более поздней (стадия формирования пыльцевых зерен у фертильной линии и полного абортирования пыльцы у стерильных). На ранних этапах гаметогенеза стерильные пыльники развиваются аналогично фертильным. Они состоят из четырех микроспорангиев (гнезд), четырехслойные стенки которых представлены эпидермисом, эндотецием, промежуточным слоем и тапетумом. Внутри гнезда пыльника локализованы многочисленные спорогенные клетки. Микроспоры (пыльцевые зерна) фертильного аналога формируются в результате двух мейотических делений спороцита. По мере роста микроспор стенки клеток тапеутма лизируются, тапетальный плазмодий проникает между клетками спорогенного комплекса. Вещество тапетального плазмодия расходуется на питание пыльцевых зерен и формирование экзины, и к концу развития в гнездах зрелых пыльников находятся лишь трехъядерные пыльцевые зерна с характерными удлиненными спермиями и шипиками на поверхности экзины. У растений с ЦМС типа RIG0 четко проявляется спорофитный характер действия ЦМС факторов, выражающийся, прежде всего, в абортивном развитии тапетальной ткани, ее

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

гипертрофии уже на стадии спорогенных клеток, что приводит к постепенной дегенерации последних. Кроме того, наблюдаются изменения в структуре органелл клеток тапетума (расширении каналов ЭПР, вакуолизация цитоплазмы, появление амебоидных ядер) и микроспороцитов (нарушение структуры митохондрий и пластид) стерильной формы по сравнению с фертильной. В целом процессы, выявленные нами при абортивном микроспорогенезе у растений с новым типом ЦМС RIG0, сходны с таковыми, описанным для ранее изученной ЦМС типа РЕТ1. Однако имеются и отличия. Так, например, на ранней стадии развития пыльника (стадия микроспороцитов) в клетках тапетума не происходит чрезмерного отложения спорополленина; форма тапетальных пластид округлая, а не овальная; оболочка гипертрофированных ядер тапетума на данной стадии не фрагментирована; ядерная оболочка микроспороцитов не образует впячиваний и выростов.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010)» № 2.1.1/4947).

БАЛАНС ПРО-/АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ В ЗЕЛЁНЫХ И

ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКАХ ПЕШНИЦЫ

–  –  –

Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского, Н. Новгород, Tom0990@yandex.ru В реакции растений на неблагоприятные условия среды большую роль играют ферменты и, в частности, пероксидазная ферментная система. Пероксидаза (ПО), являясь неспецифическим универсальным ферментом с очень широким спектром действия, реагирует на любые воздействия, оказываемые на растительный организм.

Фермент «двойного назначения», вовлечён как в процесс генерации, так и детоксикации активных форм кислорода (АФК), то несомненно повышает адаптационные возможности растений. Полиморфизм данного фермента играет ключевую роль в механизмах формирования реакций растений на действия экологических факторов, основной из которых – свет. Цель настоящей работы – исследовать влияние света на активность пероксидаз в проростках пшеницы.

Опытными объектами служили 5 дневные проростки яровой пшеницы сорта «Московская 35» (водная культура), выращенные в темноте и при 14 часовом фотопериоде.

Ферментативную активность бензидин (БПО), гваякол (ГПО), аскорбат (АПО) и НАД(Ф)Н-пероксидаз, а так же ИУК-оксидазы (ИУК-О) определяли в растворимой (цитозольной) фракции и апопласте (апопластномывающем растворе АОР) побегов и корней проростков пшеницы. Активность исследуемых ферментов регистрировали спектрофотометрически: БПО (590=39 мМ-1см-1), ГПО (470=26,6*103 М-1см-1), АПО (265=7 мМ-1см-1), НАДН-ПО (340=4,23 мМ-1см-1), НАДФН-ПО (340=6,22*103 М-1см-1), активность ИУК-оксидазы (254=18,7 мМ-1см-1). В качестве субстрата использовали раствор 4,4’диаминодифенил (0,005М), гваякол (0,05%), аскорбат (2,5мМ), НАДН (0,3мМ), НАДФН (0,3мМ) и ИУК (0,6мМ);

активность выражали в ммоль субстрата/мг ГСБ*1 мин. Концентрацию гемсодержащего белка (ГСБ) в пробах определяли спектрофотометрически (403 нм).

Сравнительный анализ исследуемых органов (корни, побеги) зелёных и этиолированных проростков выявил снижение под действием света уровня ГСБ; последнее особенно чётко зафиксировано для апопласта побегов и цитоплазматической фракции корней. Свет, снижая уровень ГСБ у зелёных проростков, оказывал разнонаправленное действие на пероксидазную и оксидазную функции пероксидазы. Выявлен активирующий (в корнях) и ингибирующий (у наземных органов) светозависимый эффект, сопровождающийся модификацией антиоксидантной активности пероксидазы. При этом активность БПО, ГПО больше изменялась в цитоплазматической, а АПО – во внеклеточной (апопластной) фракции. Светозависимые изменения прооксидантной функции пероксидазы в наших экспериментах были следующими: свет в побегах повышал активность НАДН-/НАДФН-ПО в АОР, но снижал в цитоплазматических фракциях; активность ИУК-О, наоборот, снижена в АОР и повышена в цитозоле. В корнях, в отличие от побегов, свет оказывал однонаправленное активирующее действие на прооксидантную активность ПО. Следует подчеркнуть, что модифицирующее действие света на оксидазную функцию ПО во фракциях корней было в большей степени выражено активацией ИУК-О, в частности в АОР 1,5, в цитоплазматических фракциях в 3,0 раза. Следовательно, в процессе онтогенеза при переходе проростков на автотрофный способ питания происходит переключение с пероксидазной на оксидазную активности и, тем самым баланс в пероксидазной ферментной системе смещается в сторону её прооксидантной функции. В этом смещении для побегов проростков пшеницы характерна активация (НАДН-/НАДФН-ПО) для корней - ИУК-О.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

КОЛОНИЗАЦИЯ ПРОДУЦИРУЮЩИМИ ЭКЗОГЛИКАНЫ РИЗОБАКТЕРИЯМИ PAENIBACILLUS

POLYMYXA КОРНЕЙ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

–  –  –

Эффективная колонизация корней растений ассоциативными бактериями и поддержание численности популяции на экологически значимом уровне играют важную роль в стимулировании роста растений, независимо от механизма действия (продукция метаболитов, антибиотиков против фитопатогенов, стимулирование питательными веществами или индуцирование устойчивости растений). Хорошо известно, что бактерии Paenibacillus polymyxa активно синтезируют разнообразные экзополисахариды (ЭПС), играющие, по мнению ряда авторов, существенную роль в формировании растительно-микробных ассоциаций.

Мы оценивали способность к колонизации корней проростков пшеницы штаммов P. polymyxa: 1460, 1465 и 92, отличающихся по выходу и реологическим свойствам ЭПС. Изучение прикрепления бактерий проводили на изолированных корнях трехсуточных проростков мягкой яровой пшеницы Triticum aestivum сорта Саратовская 29 методом световой микроскопии с использованием поляризационно-интерференционного микроскопа Биолар РI, методом посева на твердые питательные среды, а также с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с поликлональными антителами (Ат), полученными на изолированный препарат ЭПС.

Методом посева разведений гомогенатов корней на плотные среды установлено, что адсорбция бактерий штамма 1465 на корнях достигала через 15 мин инкубации значения 2,8 105 кл/см корня (при концентрации клеток в инокуляте 2,5 108 кл/мл) и возрастала с течением времени, составив через 24 часа 1,7 106 кл/см корня. При дальнейшем увеличении времени контакта число прикрепившихся клеток существенно не изменялось.

Сравнение динамики прикрепления штаммов P. polymyxa, отличающихся по выходу и реологическим свойствам ЭПС, показало более высокую адсорбционную способность штамма 1465 по сравнению со штаммом 1460 на всем протяжении контакта с корнями: количество адсорбированных клеток P. polymyxa 1465 в 5 раз превышало показатели для штамма 1460. Следует отметить, что бактерии P. polymyxa 1465 характеризовались наибольшим выходом ЭПС (до 4 и 12 г/л на глюкозе и сахарозе, соответственно), более высокими значениями вязкости культуральной жидкости и водных растворов ЭПС, а также большей активностью в индукции деформаций корневых волосков и при формировании биопленок на абиотических поверхностях, о чем сообщалось нами ранее.

Далее мы оценивали колонизирующую способность P. polymyxa с помощью твердофазного ИФА с поликлональными Ат на ЭПС, в результате чего нами показана перспективность применения данного метода для количественной оценки колонизации P. polymyxa корней, поскольку динамика выявления с помощью ИФА специфических бактериальных антигенных детерминант коррелировала с динамикой численности бактерий на корнях по результатам подсчета КОЕ, при этом ИФА позволял проанализировать большое количество образцов без предварительного высева на питательные среды.

На основании полученных результатов, мы предполагаем, что внеклеточные полисахариды P. polymyxa вовлечены в процесс колонизации данными ризобактериями корней пшеницы.

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ПОВЫШЕНИЯ АДГЕЗИВНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК

АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ

–  –  –

Биологическая особенность актинобактерий рода Rhodococcus – способность к окислительной трансформации природных и антропогенных углеводородов. Данное свойство определяет интерес к родококкам как объекту промышленного использования и перспективных технологий. Необходимым этапом стабилизации функциональной активности родококков является адгезия. Цель настоящей работы – исследование механизмов повышения адгезивной активности клеток алканотрофных родококков.

В работе использовали 65 штаммов родококков из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, WFCC #768, www.iegm.ru/iegmcol/index.html), принадлежащих к видам Rhodococcus erythropolis, R. fascians, “R. longus”, R. opacus, R. rhodochrous, R. ruber, и 142 мутантных клона, полученных методом неспецифического in vivo Tn5 мутагенеза клеток R. ruber ИЭГМ 231. Родококки выращивали в мясопептонном бульоне и минеральной среде в присутствии н-гексадекана или пропана в

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

условиях перемешивания (160 об/мин) при 28оС в течение 1-7 сут. Адгезивную активность бактериальных клеток изучали с использованием 96-луночных полистирольных микропланшетов (Медполимер, Санкт-Петербург) по окрашиванию прикрепленных клеток кристаллическим фиолетовым. Степень гидрофобности, заряд и величину свободной поверхностной энергии клеток родококков определяли методом микробной адгезии к растворителям (Microbial Adhesion to Solvents, МATS). Эмульгирующую активность клеток родококков, обусловленную их способностью к синтезу биосурфактантов гликолипидной природы в присутствии жидких углеводородов, определяли по индексу эмульгирования (E24ч) н-гексадекана через 24 ч. Rhodococcus-биосурфактанты экстрагировали из клеток родококков с помощью метилтретбутилового эфира и вносили их в виде раствора 1101-1106 нг/мл изопропанола в лунки микропланшетов. Общее содержание миколовых кислот в клетках родококков определяли спектрофотометрически при 494 нм после их экстракции смесью метанол:толуол:серная кислота в соотношении 25:25:1 по объему. По изменению адгезивной активности родококков после их инкубации в присутствии 0,2 мкг протеиназы К/мл среды при 160 об/мин, 28 оС в течение 3 ч судили о степени вовлеченности поверхностных белков в адгезионный процесс. Все эксперименты проводили в 3-х-8-ми повторностях.

В результате проведенных исследований установлено, что адгезивные свойства родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования бактериальных клеток.

Выявлены механизмы повышения (в 2-6 раз) адгезивной активности клеток родококков, как то: культивирование клеток родококков в присутствии жидких (н-гексадекана) или газообразных (пропана) н-алканов, повышенная (Е24ч=25%) продукция клетками родококков Rhodococcus-биосурфактантов, присутствие на поверхности твердого субстрата 10 нг биосурфактантов/мл и синтез клетками родококков адгезинов белковой природы.

Получены культуры с высокими (76-96%) показателями адгезивной активности, перспективные при разработке биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток родококков для деструкции нефтяных углеводородов.

Работа выполнена при поддержке грантов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» и программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие».

ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ В ПРОЦЕССЕ ДЕСТРУКЦИИ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА ДРОЖЖАМИ В

УСЛОВИЯХ НЕПРЕРЫВНОГО РЕЖИМА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

–  –  –

Казанский государственный университет, Казань, iriska-kiska87@mail.ru Интенсивное развитие промышленности ведет к развитию новых и усложнению уже существующих экологических проблем, в частности, проблем загрязнения окружающей среды токсичными нитроароматическими соединениями. Представителем данной категории соединений является 2,4,6тринитротолуол (ТНТ), большая часть которого была синтезирована в период Второй мировой войны и до сих пор обнаруживается в неизмененном виде как в почве, так и в поверхностных и грунтовых водах.

Для снижения техногенного влияния ТНТ и его производных на объекты природной среды необходимо создание эффективных технологий очистки высококонцентрированных ТНТ-загрязненных почв и сточных вод.

Целью нашей работы явилась оценка токсичности среды в процессе биодеградации ТНТ (100 мг/л) после формирования нестабильных моно- и дигидридных комплексов дрожжами Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 в условиях непрерывного режима культивирования.

Биодеградация ТНТ протекала в трех последовательно соединенных биореакторах с непрерывным оттоком и подачей среды, что позволило изучить более глубокие механизмы превращения ТНТ и разобщить во времени и пространстве образование метаболитов трансформации, а именно моногидридных и дигидридных комплексов.

Для составления полной картины о токсичности ТНТ и продуктов его биодеградации, полученных в условиях непрерывного режима культивирования, необходимо было исследовать токсичность с использованием различных тест-объектов. В связи с тем, что организмы на разных эволюционных ступенях развития по-разному реагируют на присутствие загрязнителей в окружающей среде, в качестве тест-объектов были выбраны простейшие Paramecium caudatum и одно- и двудольные растения.

Исследование уровня острой токсичности на тест-объекте P. caudatum выявило, что биодеградация ТНТ сопровождается снижением уровня токсичности до 10-15%. Из всех протестированных растений наиболее толерантными к присутствию в среде моногидридных и дигидридных комплексов, образовавшихся в ходе трансформации ТНТ, оказались кукуруза (Zea mays), пшеница (Triticum sp.) и ячмень (Hordeum vulgare), а наиболее чувствительными репа (Brassica rapa) и редис (Raphanus sativus).

Исходя из полученных результатов исследований можно заключить, что штамм Y. Lipolytica ВКПМ Y-3492, осуществляющий полную трансформацию исходного ТНТ (100 мг/л) по пути восстановления ароматического кольца с последующей деструкцией образовавшихся метаболитов, является подходящим объектом для

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

обезвреживания и очистки ТНТ-загрязненных объектов. Результаты данного исследования открывают перспективные возможности в проведении биотехнологических процессов очистки природных и сточных вод.

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ЭНДОФИТНЫХ БАКТЕРИЙ В МИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТАХ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО НАЗНАЧЕНИЯ

–  –  –

Башкирский государственный университет, Уфа, millenium1000@mail.ru В экологически устойчивых агросистемах большое внимание уделяется активизации всех мутуалистических взаимосвязей между главными компонентами агроэкосистемы: сельскохозяйственными растениями и тесно связанным с ним сообществом микроорганизмов. Для взаимодействия с микроорганизмами растение предоставляет множество экологических ниш – поверхность тканей, межклеточные пространства, сосуды, клетки, – образуя специализированные структуры или обходясь без них, тратит на поддержание своих микропартнеров до 1/3 своих энергетических ресурсов. В результате микроорганизмы выполняют многие значимые для растения функции: обеспечивают их азотное и фосфорное питание, защиту от фитопатогенов и вредителей, адаптацию к стрессам и регуляцию развития. При искусственном отборе культурных растений на высоком фоне минеральных удобрений и химических средств защиты растений и многие природные механизмы поддержания мутуалистических отношений между макро- и микросимбионтами были утеряны. Использование эффективных микробно-растительных консорциумов позволило бы снизить химическую нагрузку на окружающую среду, минимизировать вклад антропогенной энергии в агроэкосистему и повысить качество сельскохозяйственной продукции.

В настоящее время достигнуты большие успехи в разработке микробных средств комплексного действия на основе клубеньковых бактерий и ассоциативных ризосферных микроорганизмов для повышения продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений. Активно изучаются взаимоотношения растений с везикулярноарбускулярной микоризой, которую также используют в микробных биопрепаратах. Однако малоизученной, но перспективной группой ассоциированных с растением бактерий, являются эндофитные бактерии.

Буквально слово «эндофит» означает «внутри растения». Этот термин может быть применим к целому спектру возможных хозяев и их обитателей: бактериям, грибам, растениям и даже к животным, живущим внутри растения. С точки зрения биотических связей между партнерами сосуществование эндофитов с растениями может включать континуум взаимоотношений: паразитизм, эксплуатацию, комменсализм, мутуализм. Однако наиболее часто эндофитами определяют те организмы, чья инфекция незаметна, инфицированные ткани хозяина не проявляют признаков патогенеза, и продемонстрирована тем или иным способом колонизация микробами внутренних тканей растения.

Перспективы использования эндофитных бактерий связаны не только с целым комплексом выполняемых ими функций для растения: биоконтроль фитопатогенов, синтез фитогормонов, азотфиксация, иммобилизация фосфатов, продукция сидерофоров и др. Выявлена способность различных эндофитных бактерий к деградации ксенобиотиков, продукции большого круга метаболитов, перспективных для применения в фармакологии и медицине, синтезу биопластиков, интерес к которым резко возрос в настоящее время, и других полезных веществ. Вопросы разнообразия и свойств эндофитных бактерий, молекулярно-генетические и физиологобиохимические механизмы взаимоотношений их с растениями изучаются во многих зарубежных научных лабораториях, к ним проявляют интерес фармацевтические компании и биотехнологические центры, однако в отечественной научной литературе исследования этой группы микроорганизмов пока немногочисленны.

Учитывая, что в перспективе эндофитные бактерии могут составить альтернативу трансгенным растениям, неся в своем геноме вектор хозяйственно-полезных признаков, становится совершенно очевидно, что их роль пока недооценена.

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА У РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ

ПРИ ДЕЙСТВИИ ПОВЫШЕННЫХ ТЕМПЕРАТУР И ЗАСУХИ

–  –  –

Казанский государственный университет, Казань, dilyara89@mail.ru Экспрессия стрессзависимых генов и белков является общей реакцией всех живых организмов на неблагоприятные воздействия. Известно, что белки теплового шока (БТШ) синтезируются в ответ на

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

повышенные температуры и засуху. Функция этих стрессовых белков реализуется в первые часы действия экстремальных факторов и направлена на защиту клеток и поддержку гомеотаза. В связи с этим цель данной работы заключалась в выяснении сортоспецифических особенностей экспрессии генов ряда БТШ при различных температурных условиях. Объектом исследования являлись листья проростков восьми сортов яровой пшеницы, выращенных в почвенной культуре при 22°С в течение 7 суток (контроль). Эксперимент включал следующие опытные варианты: 1) 7-суточные проростки предварительно прогревали при 45оС 15 мин, выдерживали при 22оС в течение 2ч и затем подвергали постепенному повышению температуры (38°С – 30 мин, 40°С – 30 мин) и тепловому стрессу (42°С, 2ч.); 2) 7-суточные проростки подвергали постепенному повышению температуры (38°С – 30 мин, 40°С – 30 мин) и тепловому стрессу (42°С, 2ч.); 3) на пятые сутки выращивания растений прекращали их полив, что имитировало действие засухи, а затем 7-суточные проростки выдерживали при таких же температурных условиях, как и растения первого варианта; 4) на пятые сутки выращивания растений прекращали их полив, а затем 7-суточные проростки выдерживали при тех же температурных условиях, как и растения второго варианта. В работе исследовали экспрессию генов цитозольных БТШ с М.м. 101(101b), 90, 70 (70/1, 70/2), 17.3, 16 кДа. Выделение РНК проводили методом TRIzol, на основе РНК синтезировали кДНК с помощью специального набора («Roche», Германия) в процессе ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР).

Далее для каждого БТШ с применением специфических праймеров получали амплификаты кДНК, проводили их электрофоретическое разделение в агарозном геле и визуализацию в УФ свете. Экспрессию генов БТШ оценивали полуколичественно по ширине и интенсивности окрашивания полос амплификатов.

Установлено, что экспрессия гена БТШ101 в контрольных условиях проявлялась у трех сортов. В опытных вариантах 1, 2 и 4 активность данного гена была обнаружена у всех восьми сортов. Кратковременное действие высокой температуры на фоне засухи в сочетании с тепловым стрессом (вариант 3) индуцировало образование транскриптов этого белка только у шести сортов. Активность гена БТШ90 была обнаружена у всех сортов в контроле и при стрессовых условиях 1, 2, 3, тогда как в 4-ом опытном варианте – только у семи генотипов.

Известно, что БТШ90 часто функционирует в комплексе с БТШ70. Нами были получены результаты, отражающие сходную экспрессию генов БТШ90 и БТШ70/1 при одинаковых стрессовых режимах. В то же время, ген БТШ70/2 экспрессировался очень слабо и его активность была отмечена только при стрессовых условиях у части сортов. Транскрипты БТШ17.3 и БТШ16 выявлены в листьях всех растений опытных вариантов 1, 2 и 4, в то время как при стрессовых условиях 3 обнаружены только у пяти сортов. В контрольном варианте ген БТШ17.3 не экспрессировался вообще, а ген БТШ16 проявлял низкую активность и был отмечен только у некоторых сортов.

Таким образом, можно заключить, что БТШ70/1 и БТШ90 являются конститутивно экспрессируемыми генами и при стрессе их экспрессия усиливается. Транскрипты малых БТШ в нормальных условиях у большинства сортов не обнаруживаются, но проявляют сортоспецифическую активность при разных стрессовых температурных режимах.

ГИБРИДНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ, СОСТОЯЩИЕ ИЗ ЖИВЫХ КЛЕТОК, ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ И

УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК

–  –  –

Казанский государственный университет, Казань, ilziaysharipova@mail.ru В течение последних лет функциональные наноструктуры привлекают все большее внимание исследователей всего мира благодаря их уникальным свойствам и возможности широкого применения в различных областях.

Изучение взаимодействия клеток с наноматериалами представляет особый интерес, так как это может быть использовано для выявления токсических свойств наноматериалов, направленного изменения свойств и регуляции физиологической активности клеток. Целью работы явилась модификация поверхности клеток дрожжей наноматериалами и углеродными нанотрубками.

Для модификации клеточной поверхности был применен метод послойного нанесения заряженных синтетических полимеров. В качестве модельного объекта мы использовали пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Положительно (полиаллиламингидрохлорид) и отрицательно (полистиренсульфонат) заряженные полиэлектролиты последовательно наносили на поверхность клеток дрожжей. Следующим слоем наносили углеродные нанотрубки и закрепляли его дополнительным бислоем полиэлектролитов. В результате были получены клетки, модифицированные многослойной полиэлектролитной пленкой, содержащей в своем составе углеродные нанотрубки. Модифицированные клетки были охарактеризованы различными методами микроскопии (оптической, сканирующей электронной, просвечивающей электронной). Биохимическими и микробиологическими методами было показано, что разработанный метод модификации не влияет на жизнеспособность модифицированных клеток. Дрожжи, модифицированные нанотрубками, сохраняли физиологическую активность и способность к делению.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

Гибридные микрочастицы, состоящие из живых клеток, полиэлектролитов и углеродных нанотрубок клеток, могут служить чувствительным элементом электрохимических сенсоров. Экспериментально было установлено, что электрохимический сигнал модифицированных живых клеток и мертвых клеток отличаются. Такие биосенсоры могут быть использованы для определения токсичных соединений, антимикробных агентов, влияющих на активность и жизнедеятельность клеток.

ВЛИЯНИЕ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ НА РОСТ И БИОСИНТЕЗ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ SERRATIA

MARCESCENS В УСЛОВИЯХ ИНГИБИРОВАНИЯ БИОСИНТЕЗА ПУРИНОВ

–  –  –

Казанский государственный университет, Казань, raihan.shah@gmail.com Внеклеточная эндонуклеаза (К.Ф.3.1.30.2) грамотрицательных бактерий S.marcescens (Sma nuc) является наиболее изученным ферментом в ряду бактериальных нуклеаз с широкой специфичностью. Несмотря на значительный прогресс в исследовании эндонуклеазы, сведений о механизмах регуляции биосинтеза данного фермента недостаточно. Известно, что биосинтез эндонуклеазы увеличивается в ответ на повреждение ДНК клеток и блокирование ее репликации. При ингибировании биосинтеза пуринов происходит угнетение роста бактерий и смещение пика активности внеклеточной эндонуклеазы из стационарной фазы в экспоненциальную.

Кроме этого секреция эндонуклеазы в окружающую среду происходит сразу же, в ответ на блокирование.

Исходя из этого, мы предположили, что пурины, образуемые с участием эндонуклеазы при гидролизе нуклеиновых кислот, могут восполнить недостаток пуринов, связанный с блокированием их биосинтеза. В таком случае добавление в полноценную синтетическую среду пуринов в условиях блокирования их биосинтеза, вероятно, должно было оказывать репрессирующее действие на биосинтез эндонуклеазы и негативно отражаться на ее продукции. Таким образом, целью настоящей работы стало исследование роста S.marcescens W1050 и биосинтеза эндонуклеазы в присутствии и отсутствие экзогенных пуриновых нуклеозидов (аденозин, гуанозин и инозин) и блокатора биосинтеза пуринов 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола (2ПАБСТ).

Показано, что в отсутствие в среде нуклеозидов при ингибировании биосинтеза пуринов с помощью 2ПАБСТ происходит подавление роста микробной популяции в целом. Происходило увеличение биосинтеза и перераспределение эндонуклеазы между периплазмой и культуральной средой. Добавление в среду аденозина, гуанозина или инозина не оказывало влияния на рост и развитие клеточной популяции ни в условиях блокирования биосинтеза пуринов, ни в отсутствие блокатора. Присутствие в среде аденозина, гуанозина или инозина без 2ПАБСТ приводило к увеличению в 2-3 раза уровня нуклеазной активности в культуральной жидкости и некоторому его снижению в периплазме. Присутствие в питательной среде нуклеозидов с блокатором привело к идентичным результатам, то есть к увеличению нуклеазной активности во внеклеточной жидкости и уменьшению в периплазме. Без участия ингибитора биосинтеза пуринов биосинтез эндонуклеазы и продукция фермента за 36 часов роста культуры не изменилась в присутствии ни одного из этих пуриновых нуклеозидов. Однако в присутствии ингибитора нуклеозиды влияли на биосинтез и продукции фермента поразному. Установлено, что в присутствии аденозина количество синтезированной нуклеазы уменьшалось в 1.2 раза, а продукция – в 1.3 раза, гуанозина – в 3.2 и 2.4 раза, инозина – в 2.3 и 2.1 раза, соответственно. Таким образом, нами показано, что добавление в полноценную синтетическую среду аденозина или гуанозина или инозина вместе с ингибитором биосинтеза пуринов приводило к снижению биосинтеза и продукции эндонуклеазы, возраставших в их отсутствии под действием 2-ПАБСТ.

ВЛИЯНИЕ РАЗДЕЛЬНОГО И КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ГИПЕРТЕРМИИ И ЗАСОЛЕНИЯ

NACL НА АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ ПРОРОСТКОВ

ПШЕНИЦЫ И ГОРОХА

–  –  –

Некоторые из воздействий окружающей среды могут неблагоприятно влиять на растение, приводя к нарушению гомеостаза, недостатку тех или иных продуктов и, в конечном счете, гибели растения. Для защиты от их негативного воздействия имеется специальная система антиоксидантных ферментов. Работа посвящена исследованию изменения активности некоторых антиоксидантных ферментов (пероксидазы, о-дифенолоксидазы, супероксиддисмутазы, каталазы, глутатион-редуктазы) при раздельном действии высоких температур и

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

засоления NaCl и в ходе кросс-адаптации. Объектом исследования являются пшеница (Triticum aestivum L) Тюменская ранняя и горох (Pisium sativum L) сорта Альфа. Воздействие закаливающих (37С) температур на пшеницу приводит к повышению скорости ростовых процессов. Повреждающая температура (43С), действие моносоли и комбинированное воздействие гипертермии и засоления приводят к значительному замедлению ростовых процессов. Т.о., подавление роста можно считать наиболее легко определяемым показателем степени неблагоприятного воздействия стресс-фактора. В листьях пшеницы значительное накопление перекиси наблюдается при действии закаливающей температуры (37С), при действии повреждающей - концентрация перекиси близка к контролю. Возможно, это связано с разобщением дыхания и фосфорилирования и образованием большого количества восстановительных эквивалентов, усилением псевдоциклического транспорта электронов при фотосинтезе, увеличением роли дублирующего дыхания за счет терминальных окидаз. При комбинированном воздействии гипертермии и непосредственного засоления в листьях и корнях пшеницы наблюдается наибольшее накопление перекиси. Это показывает реакцию растения на введение второго стресс-фактора во время периода быстрой адаптации. При комбинированном воздействии с засолением через сутки в листьях пшеницы происходило увеличение количества перекиси в первые сутки, и затем резкий её спад.

Что возможно связано с закаливающим действием температуры в ходе кросс-адаптации и включением пероксидазного комплекса. Таким образом, с помощью температурной предобработки можно повысить устойчивость растений пшеницы к хлоридному засолению. Сравнение динамики активности пероксидазы и одифенолоксидазы в листьях пшеницы показывают, что с ростом активности пероксидазы наблюдается спад активности о-дифенолоксидазы. Это дает возможность предположить, что пероксидаза и о-дифенолоксидаза это один полифермент с переключаемой функцией. Воздействие закаливающих температур (37С) на горох в большинстве случаев вызывает сильно выраженное изменение активности антиоксидантных ферментов [АФ], что связано с увеличением продукции АФК дыхательной цепью и отсутствием повреждающего эффекта температуры, а повреждающая гипертермия (43С) вызывает увеличение активности каталазы и СОД через некоторый промежуток времени. Комбинированное воздействие с быстрым засолением не вызывает значительного увеличения активности АФ у гороха, что связано с переходом растений к более быстрым системам адаптации - синтезу белков теплового шока. Комбинированное воздействие на горох с засолением через сутки дает усиление активности большинства АФ, что связано с переходом растений от быстрой неспецифической адаптации к более устойчивым системам поддержания гомеостаза, таким как антиоксидантные ферменты.

ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ОРХИДНЫХ

–  –  –

Институт ботаники им. М.Г.Холодного НАН Украины, Киев, Украина, lenasheyko@mail.ru Универсальность путей морфогенеза в естественных условиях и в культуре in vitro позволяет выбрать модель для экспериментального изучения основных закономерностей и путей морфогенеза. Такой моделью может служить пыльник. Исследования морфогенетического потенциала клеток пыльника in vitro вносят определенный вклад в решение проблемы воспроизведения и размножения цветковых растений, особенно редких и исчезающих видов.

В каллусе Anacamptis pyramidalis (L.) Rich. и Orchis simia Lam. были обнаружены мелкие клетки, локализованные группами, с крупными ядрами, образующие меристематический очаг. Появление меристематических очагов означало, что в каллусной ткани начались процессы вторичной дифференциации.

Деление клеток меристематических очагов могло приводить к образованию лигнифицированных проводящих элементов сосудов и трахеид. Их образование аналогично ксилемогенезу у интактного растения и включает в себя стадии: рост клеток, вакуолезацию, отложение вторичной оболочки в условиях in vitro.

Другой путь морфогенеза в меристематических очагах – это спонтанный эмбриоидогенез. Каллусная клетка, ставшая на путь эмбриоидогенеза, относительно обособляется от окружающих клеток, ограничиваясь плотной оболочкой, увеличивается, сильно окрашивается. Обособившаяся клетка претерпевает строго направленные деления. В результате заложения ориентированных клеточных перегородок возникает четырехклеточная структура (тетрада), все клетки которой располагаются линейно. В дальнейшем формировании эмбриоида принимают участие как апикальные, так и базальные клетки, появляется многоклеточный эмбриоид. Нарушение развития эмбриоидов чаще всего выражается в неправильной ориентации клеточных перегородок при первых делениях относительно оси полярности. Часто базальная клетка делится раньше апикальной или не делится вообще. Во многих случаях наблюдается нарушение симметрии клеточных делений или асинхронность.

Клеточные перегородки закладываются хаотично, во всех направлениях. Наблюдается также нарушение соотношения размеров клеток, образующих эмбриоид. Кроме того, восьмиклеточный подвесок, характерный для зародыша, обычно сильно редуцирован. Несмотря на большое количество нарушений в ходе эмбриоидогенеза, часть эмбриоидов развивается аналогично зиготическому зародышу, проходя те же стадии: предзародышевую

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

стадию, глобулярную, торпедовидную. Таким образом, цитологический анализ каллусных культур орхидных показал ряд специфических особенностей. К ним относятся: 1) значительная структурная гетерогенность клеток, наличие различных типов образований, различающихся по морфологии; 2) связь морфологических признаков отдельных образований с их морфологическими потенциями.

ХИМИЧЕСКАЯ И ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕМБРАННЫХ, КАПСУЛЬНЫХ И

ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫХ ГЛИКОПОЛИМЕРОВ HERBASPIRILLUM SEROPEDICAE Z78

–  –  –

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Natalya.64.84@mail.ru Бактерии рода Herbaspirillum – эндофитные азотфиксирующие микроорганизмы, принадлежащие к -субклассу Proteobacteria вступают в ассоциативные взаимоотношения с корнями растений, стимулируют их рост вследствие наличия высокой азотфиксирующей активности и способности продуцировать фитогормоны.

Структурные взаимосвязи между различными углеводсодержащими молекулами данных бактерий недостаточно изучены. В связи с этим была поставлена задача провести химическое и иммунохимическое исследование поверхностных и экстраклеточных гликанов Herbaspirillum seropedicae Z78. Бактериальную культуру выращивали на жидкой синтетической среде с малатом и глюкозой до окончания экспоненциальной фазы роста.

Отделяли культуральную жидкость и осаждали полисахарид (ПСкж) этиловым спиртом. Из отмытого с поверхности клеток 0.9 % раствором NaCl капсульного материала осаждали капсульный полисахарид (КПС) добавлением ацетона в трехкратном объеме. Осадки растворяли и отделяли соли и пигменты хроматографией на колонке с Sephadex G-50. После лиофилизации выход высокомолекулярных фракций ПСкж и КПС составил 0.68 и 1.48 % соответственно от массы сухих микробных клеток. Липополисахарид (ЛПС) экстрагировали из высушенных ацетоном бескапсульных клеток по методу Вестфаль. ЛПС был выделен как из водной (ЛПСв/ч), так и из фенольной (ЛПСф/ч) частей экстракта. Выход ЛПСв/ч и ЛПСф/ч от массы сухих микробных клеток составил

1.0 и 1.5 % соответственно. Во всех образцах было выявлено наличие углеводов от 10.7 и до 34.5 %, белка от 0.2 до 4.0 %, фосфора от 0.6 до 5.0 %, 2-кето-3 дезоксиоктоновой кислоты от 0.1 до 2.9 % и следовые количества нуклеиновых кислот в ЛПС. Методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) после метанолиза в составе исследуемых гликанов были идентифицированы насыщенные, гидрокси- и ненасыщенные жирные кислоты (ЖК) с длиной углеродной цепи от С12 до С18. Во всех образцах преобладающими были 3-гидроксидодекановая, тетрадекановая, гексадекановая кислоты, а также октадеценовая в ЛПСв/ч и ЛПСф/ч и 2-гидроксидодекановая и октадекановая в ПСкж. Моносахаридный состав исследовали методом ТСХ и ГЖХ в виде ацетатов полиолов. Все образцы содержали Man, Glc, Gal, GlcN и неидентифицированный аминосахар. Помимо этого была обнаружена Xyl в ЛПСв/ч и второй неидентифицированный аминосахар в ЛПСф/ч. Иммунохимические исследования проводили с использованием антител (Ат) на целые клетки H. seropedicae Z78 обработанные глутаровым альдегидом специфически взаимодействующих с углеводными компонентами гликополимеров бактериальной поверхности. Методом двойной радиальной иммунодиффузии была выявлена перекрестная реакция Ат с ЛПСв/ч, ЛПСф/ч, и КПС. Это указывает на наличие в КПС антигенных детерминант общих с ЛПС, и как следствие на присутствие в структурах их полисахаридных составляющих одинаковых фрагментов. Методом твердофазного иммуноферментного анализа было показано, что взаимодействие Ат с ЛПСв/ч и с КПС в два раза сильнее, чем с ЛПСф/ч. Ат с ПСкж не взаимодействовали. Таким образом, бактериальная культура H. seropedicae Z78, выращенная на синтетической среде с малатом и глюкозой до окончания экспоненциальной фазы роста, продуцирует в окружающую среду полисахариды отличные по иммунохимическим свойствам от гликополимеров внешней мембраны и капсулы, но имеющие некоторые сходства в химическом составе. Работа частично поддержана грантом НШ 3171.2008.4

СОДЕРЖАНИЕ ФОСФОРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ У РАСТЕНИЙ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ

ТЕХНОГЕННОГО ЗАСОЛЕНИЯ

–  –  –

Пермский государственный университет, Пермь, ya.mashuta.89@mail.ru Техногенное загрязнение окружающей среды является одной из важных экологических проблем. Вещества, загрязняющие окружающую среду, оказывают на растение не только отрицательное воздействие, но и снижают пределы толерантности, т.е. уменьшают их устойчивость к естественным факторам среды. На Верхнекамском

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

месторождении солей производится добыча минерального сырья. Галитовые отходы производства солей, образующие солеотвалы г.Соликамска, загрязняют все компоненты ландшафта. Одной из причин угнетения растений при действии засоления является нарушение минерального, в частности, фосфорного питания.

Фосфорный обмен – одно из важнейших звеньев метаболических процессов, связанных с ростом растений.

Адаптация живых организмов к внешним условиям является энергозависимым процессом. В этом плане фосфаты играют ключевую роль, поскольку они способны к образованию разнообразных типов химических связей с малым и большим энергетическим потенциалом. В процессе регуляции солевого обмена, растения осуществляют энергозависимые процессы перекачки ионов через мембраны клеток и транспорт ионов между органами. Для оценки энергообеспеченности исследуемых растений нами было определено содержание кислоторастворимой органической фракции фосфора. В эту фракцию входят АТФ, АДФ, фосфопировиноградная кислота, фосфорные эфиры сахаров и другие соединения, принимающие участие в энергетическом обмене и биосинтетических процессах. Целью нашей работы явилось изучение влияния техногенного засоления на содержание кислоторастворимой фракции фосфора у растений, произрастающих вблизи солеотвалов г.

Соликамска в зоне неустойчивого и устойчивого засоления. Исследования проводились на 5 видах растений:

полынь обыкновенная (Artemisia vulgaris L.), клевер ползучий (Trifolium repens L.), мать-и-мачеха обыкновенная (Tussilago farfara L.), бодяк полевой (Cirsium arvense L.)и подорожник большой (Plantago major L.). На основе полученных результатов было установлено, что среди исследуемых видов самый высокий уровень кислоторастворимого органического фосфора характерен для полыни горькой. Это растение относится к группе соленепроницаемых гликофитов, которые приспосабливаются к произрастанию на засоленных почвах благодаря накоплению в тканях органических веществ – продуктов метаболизма; клетки этих растений малопроницаемы для солей. Можно предположить, что наличие кислоторастворимого фосфора способствует повышению энергообеспеченности данного вида, что имеет важное адаптивное значение в условиях техногенного засоления.

Достаточно высокий уровень кислоторастворимой фракции фосфора отмечен у подорожника большого – эврибионтного вида, способного существовать и в условиях засоления. Повышенное содержание фосфора данной фракции свидетельствует о протекании у растений данного вида защитных реакций, которые требуют энергетических и метаболических затрат. Более низкий уровень фосфатов у других исследуемых видов, вероятно, связан с расходованием энергии макроэнергетических соединений на процессы восстановления звеньев метаболизма, нарушенных избытком засоляющих ионов.

Таким образом, особенности фосфорного обмена растений в условиях антропогенного засоления отражают стратегию биохимической адаптации растений, а выявленные различия можно объяснить как видовой специфичностью, так и развитием различных адаптивных перестроек в метаболизме. Последние, очевидно, связаны с экспрессией генов NaCl-индуцируемых белков и регуляцией активности продуктов этих генов.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

МУТАЦИИ В ЦИРКУЛИРУЮЩЕЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ CEL I ЭНДОНУКЛЕАЗНЫМ АНАЛИЗОМ, КАК ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МАРКЕР ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ГРУЗА.

–  –  –

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, abdullaev.iteb@rambler.ru В последнее время растет значительный интерес к состоянию митохондриальной ДНК (мтДНК), как к более уязвимой мишени для генотоксических агентов и возможности ее использования как чувствительного маркера для прогнозирования и диагностики развития различных патологий. В докладе представлены совершенно новые (полученные впервые) данные скрининга мутантных копий мтДНК в клетках тканей и в плазме (внеклеточной циркулирующей мтДНК) мышей (BALB/c), подвергшихся воздействию ионизирующей радиацией (1-5 Гр Х-лучей). В анализах использовались образцы общей ДНК, выделенные из тканей (селезенка, головной мозг) и плазмы крови мышей в разное время после их облучения. Мутации мтДНК определяли по расщеплению CEL-I нуклеазой (фермент, специфически расщепляющий неспаренные основания) гетеродуплексов, получаемых путем гибридизации ПЦР-ампликонов участков мтДНК (ген ND3 и D-loop регион) облученных и контрольных мышей. В качестве эталонного образца для расщепления CEL-I нуклеазой был использован гетеродуплекс ПЦР-ампликонов участков дикого и мутантного гена р53 человека. Одновременно определяли изменение общего количества копий мтДНК (по гену ND4) относительно яДНК (ген GAPDH) методом ПЦР в реальном времени. Результаты показали, что метод CEL-I нуклеазного расщепления гетеродуплексов ПЦР-ампликонов является высокочувствительной тест-системой, которая позволяет провести скрининг неизвестных мутаций, индуцируемых ионизирующей радиацией. Анализ результатов указывает наличие повышенного уровня мтДНК с мутациями в клетках тканей и в плазме крови облученных мышей в течение месячного пострадиационного периода. Повышение уровня мутантных копий зависит от дозы облучения мышей. Установлено, что в тканях мозга и селезенки наибольший уровень мутантных копий мтДНК наблюдается на 8 день после облучения, с последующим снижением к 28 дню пострадиационного периода. Отметим, что снижение количества мутантных копий мтДНК в клетках пролиферирующей ткани селезенки, происходит более активно, чем в постмитотической ткани мозга. Вместе с тем, изменения общего количества копий мтДНК в тканях мышей имеют одинаковый характер и остаются на одинаковом уровне в течение пострадиационного времени. Эти данные указывают, что в клетках тканей облученных животных происходит селективная элиминация поврежденных, мутантных копий мтДНК. Это предположение согласуется с данными, полученными при анализах внеклеточной мтДНК плазмы облученных мышей. Результаты показали, что в плазме этих животных регистрируется повышенный уровень (в зависимости от дозы облучения) циркулирующих мутантных копий мтДНК. Причем, наибольший уровень повышения наблюдается (в отличие от таковой в тканях) на 14 день пострадиационного времени.

Таким образом, в клетках тканей и в плазме облученных животных обнаруживается высокий уровень мутантных копий мтДНК. Наблюдается интенсивный выброс мутантных копий мтДНК в кровоток из клеток и митохондрий (возможно в результате отсроченной гибели клеток и митофагии органелл). Внеклеточная мтДНК с мутациями в плазме крови облученных мышей, может служить чувствительным биомаркером радиационного поражения, и действия других генотоксических агентов на организм.

ПРОЛОНГИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ МЕТКИ С-14 КАК ПРОЯВЛЕНИЕ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА В

ЛИНИЯХ ДИКОГО ТИПА DROSOPHILA MELANOGASTER

–  –  –

Уральский государственный университет, Екатеринбург, antosuk-olga@mail.ru В связи с современной экологической обстановкой, остро встаёт вопрос о биологическом эффекте малых доз хронического облучения. Выбранная нами модель исследований позволяет оперативно проанализировать влияние внутреннего источника облучения на все ткани организма, включая предшественники половых клеток.

Таким образом, нашей целью являлось: проследить пролонгирующий эффект малых доз хронического облучения в ряду поколений у Drosophila melanogaster.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

Для осуществления исследований были выбраны две линии дикого типа: «Биос-3» и «Белгород», поскольку наши данные по изучению внешних источников облучения свидетельствуют об их различной радиочувствительности.

При изучении комплексного воздействия метки С-14 (доза 3 МБк) на нестабильность генома в ряду поколений рассматривались показатели жизнеспособности двух линий дикого типа Drosophila melanogaster. Особый интерес представлял морфометрический анализ крыла дрозофилы, так как облучению подвергалось только родительское поколение в конце 2-го или начале 3-го личиночного возраста, т.е. в период формирования крыла.

В ходе экспериментального анализа показателей жизнеспособности в ряду поколений у обеих линий дрозофилы было установлено, что:

при инкорпорировании лейцина, меченного по С-14, наблюдается устойчивое повышение средней индивидуальной плодовитости относительно контрольной группы;

значение частоты встречаемости поздних доминантных эмбриональных леталей максимально для родительского поколения, а далее характеризуется волнообразной динамикой в течение 5 последующих поколений;

значение частоты встречаемости постэмбриональных личиночных леталей достигает наибольшей величины в F1, а далее также характеризуется волнообразной динамикой в течение 5 поколений;

относительно частоты встречаемости куколочных леталей наблюдается значительное повышение данного показателя в родительском поколении.

Выводы:

Достоверных различий в радиочувствительности к внутреннему источнику облучения для исследуемых 1.

линий дрозофилы не было обнаружено, что, вероятно, свидетельствует о влиянии метки С-14 на работу репаративных систем организма.

За счёт стрессовой стимуляции плодовитости дрозофилы меткой С-14, невозможно достоверно оценить 2.

частоту встречаемости ранних и поздних доминантных эмбриональных леталей, значения которых, возможно, столь же высоки, как при воздействии внешних источников облучения.

Наши экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в случае высокого тератогенного эффекта метки С-14 на эмбриональной стадии развития, выжившие особи оказываются более жизнеспособными на стадии личинки. Соответственно, в следующем поколении наблюдается обратная зависимость, так как отбор вторично происходит уже на стадии личинки у F1. Данная закономерность была прослежена нами до F5.

Исходя из полученных нами данных, в течение 5 поколений наблюдается нестабильность генома в двух линиях дикого типа Drosophila melanogaster, которая проявляется в волнообразной динамике ряда показателей жизнеспособности.

–  –  –

Брянский государственный университет им. акад. И.Г. Петровского, Брянск, nasteva@list.ru В последние годы все большее значение для сельского хозяйства приобретает люпин. Эта культура, накапливая в почве до 200 кг азота на га, является прекрасным сидератом, а также содержит в семенах от 30 до 50% высококачественного белка, что обеспечивает его широкое использование в качестве корма.

Наша работа направлена на разработку и внедрение методов ДНК-маркирования для обнаружения молекулярных маркеров хозяйственно ценных признаков, что позволит существенно ускорить селекцию люпина узколистного, а в дальнейшем и проводить исследования по картированию его генома. Для селекционеров интерес представляют гены устойчивости к грибным и вирусным заболеваниям, алкалоидности, скороспелости, детерминантности, окраски вегетативных и генеративных органов и других морфо-физиологических признаков.

Первыми шагами в этой области являются обнаружение внутривидового полиморфизма и составление генетических паспортов различных сортов люпина узколистного.

Для выявления межсортовых различий межмикросаттелитных последовательностей использовали метод ISSRPCR. ДНК выделяли из пророщенных в течение 4-6 дней семян. 20 сортообразцов люпина узколистного отечественной и польской селекции были проанализированы с 19 ISSR-праймерами. Использование двух из них показывало на электрофореграмме высокомолекулярный шлейф, еще семь не показывали межсортовых различий, остальные десять давали от 1 до 10 полиморфных фрагментов. Всего выбранные праймеры позволили обнаружить 46 полиморфных фрагментов из 160 полос. Показатель внутривидового полиморфизма составил около 25%.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

При составлении формул сортов учитывались как мажорные, так и минорные фрагменты, так как они обладали высокой воспроизводимостью. Также большое внимание уделялось их интенсивности, т.к. она, как правило, не изменялась при анализе трех повторных выделений ДНК в одинаковых условиях ПЦР и нанесении на элекрофорез одинакового объема амплификата. Такой подход к анализу результатов обеспечивает наиболее полный их учет.

Длины полиморфных фрагментов измеряли с помощью программы QuantityOne.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о возможности применения метода ISSR-PCR для выявления внутривидового полиморфизма и паспортизации люпина узколистного. Составленные паспорта позволяют идентифицировать все 20 использованных в работе сортов люпина узколистного. Существуют молекулярные фрагменты, которые присутствуют во всех сортах отечественной селекции, но являются полиморфными для польских сортов. Начата работа по выявлению амплифициованных фрагментов, которые могут являться молекулярными маркерами хозяйственно ценных признаков.

ЗАВИСИМОСТЬ ВСТРЕЧАЕМОСТИ МРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ ОТ СТЕПЕНИ

ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ОПУХОЛИ ПРИ КОЛОРЕКТАЛЬНОМ РАКЕ

–  –  –

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н.Новгород, belih59@list.ru Раково-тестикулярные гены в норме экспрессируются в клетках семенников и женских репродуктивных органах. Также их экспрессия часто индуцируется при опухолевой трансформации клеток. На данный момент известно 70 семейств раково-тестикулярных генов. Функции, которые выполняют белки кодируемые этими генами, до конца не ясны, однако было показано их участие в регуляции клеточного цикла, процессах апоптоза, а также в работе транскрипционных комплексов. Ограниченная экспрессия раково-тестикулярных генов позволяет использовать их мРНК или сами белки в качестве биомаркеров опухолевого процесса. В ранее опубликованных работах описывается встречаемость мРНК этих генов в крови онкологических больных, однако в этих исследователи не сопоставляли полученные результаты со степенью дифференциации опухоли. Таким образом, задачей данного исследования стало сравнение встречаемости мРНК MAGE-A1-6, MAGE-C, XAGE, SSX, NYESO-1, PAGE и GAGE генов в крови больных колоректальным раком с разной степенью дифференциации опухоли. В ходе работы было проанализировано с использованием гнездовой ОТ-ПЦР 49 образцов периферической крови больных колоректальным раком. Результаты оценивались с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия.

Было продемонстрировано, что при злокачественной трансформации клеток и потере гистологических признаков той ткани, из которой опухоль произошла, наблюдалось возрастание количества одновременно выявляемых форм мРНК раково-тестикулярных генов. При высокодифференцированной аденокарциноме, клетки которой почти неотличимы от аналогичных клеток здоровой ткани, процент встречаемости мРНК раковотестикулярных генов был минимален - 71%. В умеренно дифференцированной аденокарциноме мРНК этих генов выявлялась в 79% протестированных образцов. В низко дифференцированных опухолях, обладающих максимальной пролиферативной активностью, процент выявления мРНК раково-тестикулярных генов составлял 100%.

С потерей признаков дифференциации изменяется и качественный состав выявляемых мРНК раковотестикулярных генов. Наиболее часто на высокой стадии дифференциации выявлялись мРНК MAGE-C и XAGE. В умеренно дифференцированой аденокарциноме наиболее часто выявлялась мРНК MAGE-A1-6. При низкой стадии дифференциации наиболее часто выявлялись мРНК MAGE-A1-6 и SSX. Таким образом, качественный и количественный состав мРНК раково-тестикулярных генов выявленных в крови больных зависит от степени дифференциации колоректального рака.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

АНАЛИЗ ПОДВИЖНОСТИ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE В ПРИСУТСТВИИ НИТРАТОВ И НИТРИТОВ

–  –  –

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, varshalomidze@yandex.ru

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

Объектом наших исследований являются бактерии Azospirillum brasilense, вступающие во взаимовыгодные ассоциативные взаимоотношения с растениями. Эти бактерии подвижны. Основная популяция клеток A. brasilense дикого типа использует для перемещения по полужидким средам роение, определяемое флагеллами и межклеточными контактами (Swa+ фенотип). По нашим наблюдениям, довольно часто в популяции A. brasilense Sp245, появляются спонтанные производные, имеющие бльшую скорость роения (Swa++). Для более подробного анализа молекулярно-генетических причин изменения поведения бактерий были выделены пять независимых производных штамма Sp245 (Sp245.P1–Sp245.P5) с ускоренным роением. Оказалось, что спонтанные перестройки, приводящие к появлению Swa++ вариантов, не обладают строгой сайт–специфичностью и в ряде случаев сопровождаются утратой гена hdfR, локализованного нами в 85-МДа плазмиде (p85) Sp245. HdfR является негативным регулятором транскрипции мастер–оперона flhDC, продукты которого необходимы для экспрессии остальных флагеллярных генов у E. coli и ряда других бактерий. Интересно, что перед выявленными в р85 генами медь-содержащей нитритредуктазы (nirK), гетеродимерной NO-редуктазы (norCB), регулятора транскрипции LysR-типа (hdfR) и каталитической субъединицы цитохромоксидазы (ccoN) есть потенциальные сайты связывания регулятора NarL, находящегося под контролем сенсора нитрата/нитрита NarX. Возможно, биосинтез не только двух ферментов денитрификации, но и кодируемых p85 белков HdfR и CcoN модулируется в ответ на NO3 и NO2. Было проведено сравнение скорости движения и особенностей социальной подвижности в присутствии нитратов или нитритов у A. brasilense Sp245 и его спонтанных суперроящихся вариантов, у двух из которых (Sp245.P1 и Sp245.P5) утрачен ген hdfR. В жидкой среде для нитратредукции (MPSS) с нитратом калия клетки вариантов Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5, выросшие в условиях интенсивной аэрации, плавали значительно быстрее, чем особи родительского штамма. При замене нитрата на нитрит у Sp245 и Sp245.P3 подвижность подавлялась, а у Sp245.P1 и Sp245.P5 скорость движения практически не снижалась. При выращивании бактерий в жидкой MPSS в условиях недостатка кислорода скорость движения клеток Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 снижалась, не зависела от источника азота и была близка к показателю, характерному для родительского штамма в сходных условиях, но в присутствии нитрата. При этом в случае Sp245 замена нитрата на нитрит в условиях недостатка кислорода приводила к подавлению подвижности клеток. Вероятно, в случае, когда создаются условия дефицита кислорода, усиливается отрицательное действие нитрита на подвижность бактерий в жидких средах. На полужидких средах (концентрация агара 0.4%) с нитратом клетки Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 двигаются быстрее родительского штамма. На среде с нитритом скорость движения клеток падает у Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245, и межштаммовые различия нивелируются. В случае штамма Sp245.P5 замена нитрата на нитрит не влияет на подвижность бактерий. Оказалось, что на полужидкой среде с нитритом калия все исследованные варианты Sp245.P утрачивают способность к ускоренному, по сравнению с диким типом, роению, за исключением штамма Sp245.P5. Таким образом, были выявлены различия в поведении спонтанных вариантов Sp245.P с изменениями в структуре p85, имеющих одинаковый суперроящийся фенотип в средах с солями аммония, при замене источников азота в среде на нитрат или нитрит.

АНАЛИЗ ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ПОЛИМОРФИЗМА +3247 A/G ГЕНА ЦИТОКИНА IL-6 СРЕДИ ТАТАР В ПОПУЛЯЦИИ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН

Габбасов Р.Т., Ахатова Ф.С., Ризванова Ф.Ф., Ризванов А.А., Кравцова О.А.

–  –  –

Мутации в различных участках генов, кодирующих цитокины (иммуномодулирующие белки, активирующие Тлимфоциты) могут приводить к изменению экспрессии данных белков, что повышает риск проявления той или иной патологии. Цитокин IL-6 стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов. Гомозиготность по некоторым из девяти известных полиморфных аллелей гена IL-6 может приводить к патологии. Например, аллель А рассматриваемого нами полиморфизма +3247 A/G в IL-6 связывают с лимфоцитозом. Создание методов диагностики предрасположенности к заболеваниям требует популяционного анализа частоты встречаемости исследуемого цитокина в конкретной популяции людей.

Цель работы - оценить распределение частот аллелей полиморфизма +3247 A/G IL-6 среди татар в популяции Республики Татарстан (РТ) по сравнению с общей популяцией РТ.

Материалы и методы: методом фенольной экстракции выделили ДНК из крови 118 добровольцев – татар, а также 124 добровольцев – без учета национальности. Определение генотипа проводили методом ПЦР со специфичными праймерами для аллелей +3247 A/G гена IL-6. Внутренним контролем служил ген hgh. Анализ продуктов амплификации проводили в 2% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Статистический же анализ - методом 2.

Результаты и обсуждение. Частоты распределения генотипов AA, AG и GG составили: у татар в популяции РТ в общей популяции РТ - 54,6/ 36,7 /8,7% соответственно (р 0,03). Таким образом разработка

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

тест систем на основе полиморфизма генов на территории РТ возможна только с учетом национального признака, что связано как с техническими, так и этическими сложностями. Полученные данные также могут применяться в этнографических исследованиях.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА СТАРТОВЫХ КОДОНОВ ДЛЯ

ИЗУЧЕНИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОЙ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО ГЕНА speAegfp.

<

–  –  –

Ген speA супрессирует патогенность батерий Erwinia carotovora. Структурная часть гена представляет собой протяженную открытую рамку считывания (ОРС), состоящую из 368 аминокислот. Особенностью данной ОРС является наличие в её пределах 6 кодонов АUG, потенциально претендующих на роль инициирующих. Перед тремя из них (start 2, start 4 и start 6) располагаются пурин-богатые участки, в различной степени обладающие гомологией с последовательностью Шайна-Дальгарно (SD1, SD2 и SD3, соответственно). Три других кодона лишены последовательностей SD. С целью проверки функциональной активности in vivo всех имеющихся SD создан ряд генетических конструкций, где использован ген зелёного флуоресцирующего белка, egfp, в качестве репортерного. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о различной функциональной активности всех трех исследуемых структур. В одной из конструкций ген egfp соединен с 5-концевой частью гена speA, где он поставлен сразу после инициирующего кодона start 6 гена speA. В результате вестерн-блот анализа, проведенного с применением поликлональных антител к GFP, показано наличие ряда сигналов разной интенсивности, соответствующих белкам с различными молекулярными массами. Это свидетельствует об одновременном, но неравнозначном участии в инициации трансляции всех трех структур SD. Установлен также факт инициации трансляции со стартовой точки 1, не имеющей перед собой последовательности SD. Причем для этого необходимо, по всей вероятности, присутствие нуклеотидной последовательности, расположенной между стартовыми точками 1 и 2, поскольку постановка гена egfp непосредственно под стартовую точку 1 не приводила к его экспрессии. Для дополнительного подтверждения факта альтернативной инициации трансляции гена speA на базе векторной плазмиды pET28b была создана конструкция, в которой полноразмерный ген speA соединён с репортёрным геном зелёного флуоресцирующего белка. Продукт этого рекомбинантного гена представляет собой химерный белок, состоящий из двух доменов. N-концевым доменом является белок SpeA, который на C-конце слит с белком GFP. Достоинство данной конструкции заключается в том, что, во-первых, в ней имеются все потенциальные стартовые кодоны и регуляторные элементы для инициации трансляции, а, вовторых, наличие домена флуоресцирущего белка позволяет осуществлять непосредственную детекцию инициации трансляции при биосинтезе химерного белкового продукта. Проведен сайт-направленный мутагенез инициирующих кодонов start 2 и start 6 рекомбинантного гена speA-egfp, приводящий к превращению триплета АUG в триплет CUG и, соответственно, к замене метионина на лейцин. В результате получены три мутантные конструкции, в которых последовательно элиминированы инициирующие кодоны start 2, start 6 и оба кодона вместе. Клетки E. coli, трансформированные этими конструкциями, сохранили способность к флуоресценции подобно контрольным клеткам, содержащим исходную плазмиду, что свидетельствовало об инициации трансляции с нескольких стартовых точек. Вестерн-блот анализ белков мутантных клонов, продемонстрировал изменение спектра сигналов по сравнению с контролем. У мутантов наблюдалось исчезновение тех белков, в мРНК которых происходила элиминация инициирующего кодона.

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА И ЭКЗОН-ИНТРОННОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНА ТУБУЛИНА-2 ПЕЧЁНОЧНЫХ СОСАЛЬЩИКОВ FASCIOLA HEPATICA И ДРУГИХ ТРЕМАТОД

–  –  –

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |
Похожие работы:

«ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА ОБЩЕСТВЕННОГО РАЗВИТИЯ (2012, № 8) УДК 316.012 Солодовник Любовь Владимировна Solodovnik Lubov Vladimirovna соискатель кафедры социологии, PhD applicant, политологии и права Institute for Continuing Education Института по переподготовке and Retraining of и повышению квалификации Sou...»

«БЕЛКОВЫЕ И УГЛЕВОДНЫЕ КОМПОНЕНТЫ В ЛУКОВИЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ У ВЗРОСЛЫХ ХРЯКОВ И БАРАНОВ Цыдыпов Р.Ц. Резюме В луковичной железе обнаруживаются многочисленные дольки, в которых располагаются секретирующие отделы и выводные протоки. В цитоплазме мукоцитов и секрете со...»

«K ANTENnews Выпуск 20 Революция в дизайне столешниц. Digital-Edge — новый этап в  дизайне кромок. Современная мебель благодаря эффекту "нулевого шва" Fusion-Edge — высокоэффективная  кромка для всех технологий соединения. KSP 2.0 Настоящая новинка: расширение  ассортимента и уникальные возможности  сервиса от Dllken. Структурные поверхности...»

«Решение Ректората БГПУ им. М. Акмуллы Протокол № 3 от 14 ноября 2016 г. О PR-продвижении научно-образовательных программ и проектов вуза в условиях модернизации профессионального образования Главной задачей отдела по связям с общественностью и рекламе является работа над имиджем вуза, который фор...»

«Ермакова Елена Владимировна, Мезина Людмила Геннадьевна ДУХОВНЫЙ ОПЫТ ЧЕЛОВЕКА В ВЫБОРЕ ЖИЗНЕННОГО ПУТИ В статье проводится мысль, что духовный опыт человека играет ключевую роль в выборе жизненного пути. В этой связи подчеркивается, что духовный опыт...»

«ПАПА ФРАНЦИСК MISERICORDIAE VULTUS БУЛЛА ПО СЛУЧАЮ ВНЕОЧЕРЕДНОГО ЮБИЛЕЯ МИЛОСЕРДИЯ ФРАНЦИСК ЕПИСКОП РИМА РАБ РАБОВ БОЖИИХ ИСПРАШИВАЕТ ВСЕМ ЧИТАТЕЛЯМ ЭТОГО ПОСЛАНИЯ БЛАГОДАТЬ, МИЛОСЕРДИЕ И МИР 1. Иисус Христос – это мило...»

«Электронная библиотека Тверские авторы Святослав Борисович Михня *** Не замечая круговерть часов, брожу я, незримо впитываю смерть пока чужую, поскольку сам ещ терплю, смотрю и вижу: жизнь устремляется к нулю, к зиме поближе. С двойною рамою окно мо открыто. Небес холодных полотно дождем омыто; он коготками...»

«Генерация шумовых колебаний на сверхвысоких частотах в транзисторных регенеративных усилительных системах С. В. Савельев ФИРЭ им. В. А. Котельникова РАН, Фрязино, пл. Введенского 1, e-mail: savelyev@ms.ire.rssi.ru Предложена методика построения источников широкополосных и сверхширокополосных шумовых колебаний в диапаз...»

«Военная литература Ежемесячный информационно-библиографический указатель книг, журнальных и газетных статей, 2012, № 12 Подготовлен в Отделе военной литературы РГБ Составители: И.М. Вялова, С.Д. Голомазова, Е.В. Дорохина Библиографический редактор С.Д. Голомазова От составителей Отдел военной литера...»

«ЭТИЧНОЕ ЛИДЕРСТВО Сборник эссе финалистов Глобального конкурса "Стратегическая матрица – 2015" Москва, 2015 Обращение Организационного комитета Глобального конкурса "Стратегическая матрица 2015" Уважаемые коллеги, партнеры, друзья! 23 апреля 2015 го...»

«Приложение №2 к приказу от 10.12.2013 № 231 ЗАКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО КОМЕРЧЕСКИЙ БАНК “Квота-банк” Тариф ВОЗНАГРАЖДЕНИЯ БАНКА ЗА ВЫПОЛНЕНИЕ ПОРУЧЕНИЙ КЛИЕНТОВ ПО ОПЕРАЦИЯМ В ВАЛЮТЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ И ИНОСТРАНОЙ ВАЛЮТЕ черезсистему дистанционного банковского обслуживания Действует с "10" декабря 2013г. СОД...»

«НАУЧНЫ Е ВЕДО М ОСТИ С е р и я М е д и ц и н а. Ф а р м а ц и я. 2 01 2. № 2 2 (1 4 1 ). В ы п у с к 20/1 167 УДК: 582.949.27 АМИНОКИСЛОТНЫЙ И МИНЕРАЛЬНЫЙ СОСТАВ ТРАВЫ ГАЛИНЗОГИ РЕСТНИТЧАТОЙ (GALINSOGACILIATA (RA...»

«К оглавлению Серия: Записки дряхлого супермена Игорь Н. Бекман ВЕРХОЯНСКАЯ САГА или КАНИКУЛЫ В АДУ или КАК Я ПРОВЁЛ ЛЕТО Часть 4. Идти пришлось прямо по руслу реки. От судьбы не уйдёшь Больше всех рискует тот, кт...»

«КРИЗИС ТЕПЛООБМЕНА ПРИ ВЫНУЖДЕННОМ ТЕЧЕНИИ ПАРОВОДЯНОЙ СМЕСИ В СБОРКЕ СТЕРШИ В СТАЦИОНАРНЫХ И НЕСТАЦИОНАРНЫХ РЕЖИМАХ И.С.Дубровский, Т.Югай, МЛ.Гашенко, А.Ф.Чалых ЭНИН им. Г.И.Кржижановского, ЗИЛ t СССР АННОТАЦИЯ. Представлены результаты экспериментального исследования кризиса теплообмена в сборках стержней...»

«United Nations Audiovisual Library of International Law Конвенция о сокращении безгражданства Гай С. Гудвин-Гилл Старший научный сотрудник, Колледж "Олл Соулз", Оксфорд Принятая в 1954 году Конвенция о статусе апатридов преследовала ограниченные цели, а именно: определить апатридов как категорию, урегулировать и улучшить...»

«Оглавление ПРЕЗИДЕНТ Путин подписал закон об ограничении числа наблюдателей на выборах Владимир Путин определил ответственных за состояние дорог Путин подписал закон о запрете оказывать господдержку компаниям с офшорной юрисдикцией. 5 Путин подписал закон о совершенствовании государственной военной службы РФ Путин подписал законы о праве оспорить разъясняющие законодательство акты госорганов Путин п...»

«итоговая версия (20.02.2015) Приложение 1 Единый научный Рубрикатор Настоящий Рубрикатор является неотъемлемым Приложением к "Регламенту оценки.".Рубрикатор призван решать следующие задачи: точное определение научной специализа...»

«1    ВЛАДИМИР СИМОНОВ Прозрачневение пеЛелистыванием Прозрачневение нач. 19.01.2014, Киев пеЛелистывание продолжено 25.03.2014, Лос-Анджелес 2    МИРОЧУВСТВОВАНИЕ НОВОЙ ЭПОХИ Прозрение перспективой востребует новейших ориентиров жизнетворчества Существования. Книги Владимира Симонова позволяют отк...»

«А. Б. Кувалдин, М. А. Федин Идентификация индукционных тигельных печей и миксеров как объектов управления и разработка параметрической системы регулирования температуры расплава Индукционный нагрев широко используется для плавки различных металлов и сплавов. По назначению установки индукционной...»

«УДК 811 ПОЛИТИЧЕСКАЯ ТЕРМИНОЛОГИЯ В РЕЛИГИОЗНО-ФИЛОСОФСКИХ ПРОИЗВЕДЕНИЯХ И.А. ИЛЬИНА © 2012 С. Н. Стародубец докт. филол. наук, зав. каф. гуманитарных дисциплин, доцент e-mail: strmos@rambler.ru Брянский го...»

«питАННЯ глОтОДиДАктики І метОДики ВиклАДАННЯ мОВи R. Grenarov NEW EDUCATIONAL INFORMATION TECHNOLOGIES IN TEACHING THE RUSSIAN LANGUAGE The paper deals with the use of new Educational information technologies in teaching the Russian language, new possibilities of using informational technologies in education, the technology of...»

«INT-ADR Модуль расширения адресных зон int-adr_ru 05/14 Модуль расширения INT-ADR позволяет расширить систему максимально на 48 адресных зон. Он поддерживает извещатели, в которых установлен адресующий модуль CA-64 ADR-MOD. Модуль расширения работает совместно с при...»

«Information about the authors 1. Ambarova Polina (Yekaterinburg, Russia) – PhD, associate professor, Ural Federal University named after the first President of Russia B.N. Yeltsin (Yekaterinburg, Mira St., 19, Russia, 620002, borges75@mail.ru) 2. Zborovsky Garold (Yekat...»

«Автоматизированная копия 586_425807 ВЫСШИЙ АРБИТРАЖНЫЙ СУД РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПОСТАНОВЛЕНИЕ Президиума Высшего Арбитражного Суда Российской Федерации № 6332/12 Москва 11 декабря 2012 г. Президиум Высшего Арбитражного Суда Российской Федерации в составе: председательствующего – Председателя...»

«Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение основная общеобразовательная школа № 3 г. Ковдор Мурманской области РАССМОТРЕНО СОГЛАСОВАНО УТВЕРЖДАЮ на заседании ШМС Зам. директора по УВР Врио директора МБОУ ООШ № 3 протокол № 6 от 31.08.2016 г. _ Руководитель ШМС Пояркова Н.М. Пояркова Н.М. _ 31.08.2016 г Приказ № 89 от...»

«© Современные исследования социальных проблем (электронный научный журнал), №11(19), 2012 www.sisp.nkras.ru УДК 378.1 ВЛИЯНИЕ ИРРЕЛЕВАНТНОЙ ИНФОРМАЦИИ НА ПРОЦЕСС РАЗГАДЫВАНИЯ АНАГРАММ Медынцев А.А. Цель Целью исследования являлось изучение влияния результата выполнения побочного задания (за...»

«Оценка уровня внутриотраслевой торговли лесной, деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности Беларуси Владимир Валетко Белорусский государственный технологический университет uladzimir.valetka@gmail.com Первая версия: 10 сентября 2009 Обновлено 23 марта 2010 Предварительный неполный вар...»

«Cерия натуральной косметики по уходу за лицом и телом из самого центра Италии Флоренции Настоящие эмоции 3-4 СЕРИЯ "БЕЛЫЙ ЧАЙ" СЕРИЯ "ЯБЛОКО И ТЮЛЬПАН" 5-6 СЕРИЯ "ЛАКРИЦА И МАНДАРИН" 7-8 9-10 СЕРИЯ "ПИОН И ЛАЙМ" СЕРИЯ "ЦВЕТЫ КЬЯНТИ" 11-12 СЕРИЯ "...»

«Конспект занятия по валеологии в старшей группе "Тело человека. Органы чувств". Цель: Дать детям представления об органах чувств, как наших помощниках в познании окружающего мира.Задачи: Обобщать имеющиеся у детей...»








 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.