WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |

«Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского Национальный исследовательский университет Всероссийская общественная организация ...»

-- [ Страница 4 ] --
Печёночные сосальщики являются возбудителями такого широко распространённого гельминтоза как фасциолёз. Им могут быть поражены многие виды диких и домашних животных, а также человек. В ветеринарии для борьбы с фасциолёзом широко используются препараты семейства карбаматбензимидазолов, в частности альбендазол, механизм действия которых основывается на нарушении полимеризации микротрубочек за счёт связывания антигельминтика с тубулином-. В результате действия этих препаратов в организме фасциолы происходит разрушение цитоскелета клеток, образующих тегумент, а также нарушается нормальный процесс деления клеток на стадии метафазы. Следует отметить, что -тубулин имеет ряд изотипов, например тубулин-1, тубулин-2, тубулин-3 и т.д., кодируемых соответствующими ядерными генами (tubb1, tubb2 и т.д.). Известно, что в течение десятилетий применения альбендазола появились штаммы фасциол устойчивых к его воздействию.

Показано, что для нематод эта резистентность ассоциирована с изменениями в структуре генов тубулина. Поэтому целью нашей работы было определение экзон-интронной структуры гена tubb2 у трематод разных видов и поиск полиморфизма, связанного с устойчивостью к действию альбендазола. Для экспериментального изучения был выбран печёночный сосальщик F.hepatica (определение вида производилось на основании нуклеотидных последовательностей ядерного локуса ITS2). Выделение тотальной ДНК из взрослых фасциол проводили по стандартной фенол-хлороформной методике с использованием протеиназы К.



Затем проводили реакцию амплификации и разделяли её продукты в 1,5% агарозном геле. Подбор праймеров осуществлялся на основании известных в GeneBank последовательностей кДНК гена tubb2 F.hepatica из Великобритании. Для элюции и последующего клонирования был выбран фрагмент длиной около 1300 п.н., что примерно равно длине гена tubb2 у трематод Schistosoma mansoni и Schistosoma japonicum. Секвенирование показало, что ген tubb2 у F.hepatica состоит из 3 экзонов и 2 интронов. Первый экзон имеет длину в 57 п.н., второй – 468 п.н., а третий – 807 п.н.;

длина первого и второго интронов составила 185 п.н. и 86 п.н. соответственно. Трематоды из родов Schistosoma и Fasciola не отличаются между собой по числу экзонов и интронов. Однако, второй интрон и третий экзон оказался у шистосом намного длиннее (315 п.н. и 912 п.н. соответственно), а первый интрон короче (87 п.н.).

Сравнение последовательностей экзонов F.hepatica показало, что доля вариабельных сайтов составляет 5.8%, а доля несинонимичных замен – 23.6%. Сравнение нуклеотидных последовательностей первых двух экзонов у F.hepatica, S.mansoni, S. japonicum и Clonorchis sinensis показало, что доля вариабельных сайтов у пары видов F.hepatica и S.mansoni составляет 23.4%, у F.hepatica и S.japonicum – 24.3%, у F.hepatica и C. sinensis – 24.3%, большая часть которых представлена несинонимичными заменами (от 71.1% до 75.0%).

Планируется дальнейшее изучение полиморфизма генов тубулина и их распределения в российских популяциях печёночных сосальщиков.

МАТРИЧНАЯ РНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ В КРОВИ И ОПУХОЛЕВЫХ ОЧАГАХ БОЛЬНЫХ РАКОМ ПОЧКИ

Гуррам Н1, Новиков Д.В1, Березин К.В2, Белова Т.В1, Калугин А.В1 Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н.Новгород mbre@mail.ru Нижегородская государственная медицинская академия, Н.Новгород Рак почки является относительно редкой формой рака и занимает 10 место по уровню заболеваемости среди злокачественных новообразований.




Тем не менее, разработка методов мониторинга и способов ранней диагности рака почки является актуальной задачей. Среди опухоле-ассоциированных антигенов выделяют группу раково-тестикулярные антигенов, которые обнаруживаются в опухолевых клетках различного происхождения в различных комбинациях и имеют прогностический потенциал. Транскрипция генов MAGE-A наблюдается в клетках первичных и метастатических опухолей различных гистологических типов. Активация транскрипции раково-тестикулярных генов происходит вследствие гипометилирования генома опухолевых клеток. Ограниченная экспрессия генов позволяет использовать мРНК раково-тестикулярных антигеноов в качестве маркера присутствия раковых клеток в различных тканях человека. Показано, что обнаружение мРНК ряда раковотестикулярных антигенов в опухолевых клетках ассоциировано с неблагоприятным прогнозом течения заболевания. Обнаружено, что мРНК, кодирующая раково-тестикулярные антигены, встречается не только в клетках опухолевых очагов, но и в периферической крови онкологических больных, что свидетельствует о циркуляции в кровотоке метастазирующих опухолевых клеток или наличии в крови продуктов деградации опухолевых клетов. К раково-тестикулярным антигенам относятся ранеее обнаруженные антигены XAGE, GAGE и SSX. Задачей настоящего исследования явилось исследование встречаемости матричной РНК раково-тестикулярных XAGE, GAGE и SSX антигенов в крови и опухолевых очагах больных раком почки.

В работы исследованы образцы периферической крови и клеток опухолевых очагов полученные от 54 больных раком почки, проходивших лечение в Приволжском медицинском центре (г. Нижний Новгород). Матричную РНК раково-тестикулярных антигенов определяли методом гнездовой ОТ-ПЦР с применением разработанных

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

авторами праймеров. Праймеры позволили проводить детекцию мРНК представителя семейства генов XAGE XAGE-1, одновременную детекцию мРНК девяти представителей семества генов GAGE – генов GAGE1 GAGE9 (GAGE1-9) и трех одновременную представителей семейства генов SSX - SSX-1, SSX-2, SSX-4 (SSXРезультаты реакции учитывали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.

В образцах опухолевых очагов больных раком почки матричные РНК XAGE-1, GAGE1-9 и SSX-1,2,4 антигенов выявлялись в 41, 52 и 76 % случаев, соответственно. В периферической крови больных раком почки матричные РНК XAGE-1, GAGE1-9 и SSX-1,2,4 антигенов выявлялись в 43, 67 и 83 % случаев, соответственно. На первой стадии рака почки мРНК раково-тестикулярных антигенов XAGE-1, GAGE1-9 и SSX-1,2,4 выявлялась в периферической крови у 46, 61 и 92% больных, соответственно. Таким образом, при раке почки как в опухолевых клетках, так и периферической крови обнаруживается матричная РНК различных раково-тестикулярных антигенов. Высокая встречаемость мРНК тестированных антигенов на первой стадии заболевания свидетельствует о возможности использования тестов на их определение при разработке новых методов ранней диагностики рака почки.

Исследование поддержано ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009годы, ГК №П802.

<

–  –  –

Метилирование ДНК – один из механизмов эпигенетической наследственности эукариот. Большинство современных методов направлены на изучение CG-метилирования отдельных генов или непротяженных участков генома. Однако наравне с CG-метилированием у растений и млекопитающих наблюдается метилирование симметричных (CNG) и несимметричных (CNN) последовательностей (N – любой нуклеозид).

Недавно было обнаружено, что CNG-метилирование ДНК преобладает в стволовых клетках (при этом около 15% всех метилированных цитозинов входят в состав последовательностей CWG (W – A или Т)) и мало представлено в дифференцированных клетках. Предполагается, что такой тип метилирования играет ключевую роль в возникновении и поддержании плюрипотентного статуса стволовых клеток. Однако до последнего времени значение CNG-метилирования ДНК практически не исследовалось из-за отсутствия быстрых и недорогих методов анализа.

Нами предлагается простой и изящный метод анализа CNG-метилирования ДНК высших эукариот. Метод отличаются использованием малых количеств ДНК (10 нг – 1 мкг) и быстрым получением результата.

Предложенный подход основан на расщеплении ДНК двумя сайт-специфическими эндонуклеазами: EcoRII-C – чувствительна к метилированию сайта CCWGG и AjnI – метилнечувствительна. Все этапы метода отработаны в модельных экспериментах с использованием смесей метилированной и неметилированной ДНК фага лямбда и плазмидных ДНК. Скорость проведения анализа обеспечивается применением простой технологии с использованием магнитных шариков, позволяющей выделять метилированные фрагменты из полного генома. Полученные фрагменты ДНК, содержащие метилированные сайты CCWGG, можно использовать в последующих операциях. А именно, статус метилирования определенной области можно легко оценить с помощью ПЦР в реальном времени или стандартной ПЦР, а статус метилирования большого числа генов или целого генома можно проанализировать с использованием методов профилирования ДНК, основанных на микрочипах или секвенировании.

В результате проделанной работы составлена библиотека тэгов в векторе pUC18 и впервые показана локализация метилированных сайтов CCWGG в геномной ДНК крысы Rattus norvegicus. Дальнейшие исследования направлены на повышение разрешающей способности метода. Планируется использование IIS-эндонуклеазы MmeI, которая производит расщепление ДНК в стороне от сайта узнавания на расстоянии 18/20 нуклеотидов.

–  –  –

Елисеев Б.Д.1, Крючкова П.Н.1,2, Алкалаева Е.З.1, Фролова Л.Ю.1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, eliseev@vega.protres.ru;

–  –  –

Биосинтез белка осуществляется наиболее крупной и сложноустроенной клеточной молекулярной машиной – рибосомой – с участием белков, названных факторами трансляции. Заключительная стадия этого процесса начинается после узнавания стоп-кодона - сигнала остановки белкового синтеза на мРНК. Далее происходит освобождение готового полипептида из рибосомы. В организмах с универсальным генетическим кодом 61 смысловой кодон используется для кодирования 20 природных аминокислот, а три кодона UAA, UAG и UGA являются стоп-кодонами. Ресничная инфузория Euplotes aediculatus обладает вариантным генетическим кодом и использует в качестве стоп-кодонов UAA и UAG, в то время как UGA кодирует цистеин.

Известно, что за декодирование стоп-кодонов у организмов с универсальным кодом отвечает N-домен фактора терминации eRF1, поэтому мы предположили, что у Euplotes для запрета узнавания UGA как стоп-кодона в аминокислотной последовательности N-домена eRF1 должны были произойти соответствующие изменения.

Был проведен анализ данных множественного выравнивания аминокислотных последовательностей eRF1 из организмов с универсальным и вариантными кодами, а также данных пространственной структуры, и выделены части N-домена eRF1 Euplotes, которые предположительно могут запрещать узнавание этим фактором кодона UGA. На основе eRF1 человека были получены химерные белки, содержащие такие участки последовательности Euplotes, и определена их специфичность в узнавании стоп-кодонов в реконструированной эукариотической системе трансляции in vitro. Химерный белок, который не узнавал UGA, содержал участок последовательности Euplotes в середине N-домена (70-80 а.о.). Эта последовательность в структуре домена включает часть спирали 3. Были также получены и исследованы мутантные белки по отдельным аминокислотным остаткам в этой области. Было выяснено, что аминокислотный остаток 70 вносит основной вклад в запрещение узнавания UGA как стоп-кодона белком eRF1 Euplotes. Аналогичный подход привел ранее к локализации аминокислот, запрещающих узнавание кодонов UAA и UAG как стоп-кодонов у инфузорий рода Stylonychia, в ином участке N-домена фактора терминации. Наши результаты позволяют высказать новые предположения относительно механизма узнавания стоп-кодонов при биосинтезе белка.

ЭКСПРЕССИЯ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ АДРЕНАЛИНОВОМ МИОКАРДИТЕ

–  –  –

Воронежский государственный университет, Воронеж, iskusnykh777@mail.ru В основе адреналинового миокардита лежит усиление окислительных процессов при нарушении работы системы антиоксидантной защиты (САЗ), приводящее к развитию оксидативного стресса. При адреналиновом миокардите образование активных форм кислорода некомпенсируется САЗ клеток, в которую входят ферментативные и неферментативные компоненты. Восстановленный глутатион является компонентом неферментативного звена САЗ, обеспечивая непосредственную детоксикацию АФК, свободных радикалов и гидропероксидов. Восстановление окисленного глутатиона происходит в ходе глутатионредуктазной реакции, функционирование которой осуществляется только при постоянном притоке в реакцию восстановительных эквивалентов в форме NADPH, образующихся, преимущественно, в ходе работы окислительной ветви пентозофосфатного пути, ключевым ферментам которого является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ). В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение количественной экспрессии гена Г6ФДГ в сердце самцов белых крыс (Rattus rattus) с адреналиновым миокардитом с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Для индуцирования миокардита крысам вводили подкожно 0,1% раствор адреналина в количестве 150 мкл на 100 г веса организма. Эксперимент проводился в несколько этапов: экстракция тотальной РНК тризоловым методом, удаление примесей геномной ДНК из выделенной тотальной РНК, обратная транскрипция и ПЦР-амплификация в режиме реального времени на приборе АНК-32. Для проведения ПЦР использовали набор, содержащий интеркалирующий краситель SYBR GreenI фирмы «Синтол» и праймеры, подобранные с помощью программы Genamics Expression. Полученные значения пороговых циклов реакций (Ct) были нормализованы относительно Ct трех генов “домашнего хозяйства” и статистически обработаны с помощью программного обеспечения "Relative Expression Software Tool – 2008".

Проведенное исследование показало, что экспрессия гена Г6ФДГ с учетом эффективности амплификации увеличивается при адреналиновом миокардите в 5,9 раз. Имеющаяся в настоящее время научная информация свидетельствует о повышении активности Г6ФДГ в условиях токсического гепатита, сопровождающегося интенсификацией свободнорадикальных процессов. Считают, что увеличение активности данного фермента обеспечивает устойчивость клеток к окислительному стрессу. Ряд данных свидетельствует о возможности изменения активности Г6ФДГ за счет конформационных изменений молекулы фермента. Однако вопрос о регуляции экспрессии Г6ФДГ оставался открытым. Наши данные указывают, что одним из механизмов повышения

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

активности Г6ФДГ при оксидативном стрессе, вызванном, в частности, развитием адреналинового миокардита, может быть гиперэкспрессия фермента. Таким образом, необходимость поставки восстановительных эквивалентов для усиленной работы глутатионовой САЗ в условиях оксидативного стресса приводит к увеличению экспрессии Г6ФДГ при развитии адреналинового миокардита.

ПРИСУТСТВИЕ мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ В КРОВИ И КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕВЫХ ОЧАГОВ ПРИ МИОМЕ МАТКИ

Калугин А.В.1, Белова Т.В.1, Плеханова Е.С.1, Новиков Д.В.1, Конторщикова Е.Ю.2 НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ, Н.Новгород, KAV290485@yandex.ru Нижегородская государственная медицинская академия, Н.Новгород При неопластической трансформации возможна реактивация генов, кодирующих раково-тестикулярные антигены, в норме характерные для герминальных клеток семенников и неподнадзорных иммунной системе органов. Одними из них являются NY-ESO-1, SSX-1,2,4, XAGE-1, GAGE1-8 и PAGE-1 антигены. Выявление мРНК, кодирующих раково-тестикулярные антигены, в периферической крови человека может указывать на наличие процесса клеточного перерождения. Целью данного исследования является сравнение спектров мРНК раковотестикулярных антигенов SSX-1,2,4, NY-ESO-1, XAGE-1, GAGE1-8, PAGE-1 в периферической крови и клетках опухолевых очагов больных миомой матки.

Матричные РНК SSX-1,2,4, NY-ESO-1, XAGE-1, GAGE1-8 и PAGE-1 выявляли в периферической крови и клетках опухолевых очагов 33 больных миомой матки с помощью обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Результаты ОТ-ПЦР оценивали методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромида этидия.

Установлено, что суммарная частота обнаружения мРНК данных антигенов в клетках опухолевых очагов составила 36 %, а в периферической крови – 33 %. В образцах опухолевых очагов чаще обнаруживались мРНК XAGE-1 (27%) и SSX-1,2,4 (18%), реже – мРНК GAGE1-8 (6%), а мРНК NY-ESO-1 и PAGE-1 – отсутствовали.

При этом мРНК двух антигенов определялись в 12 % случаев, а одного антигена – в 27% случаев. Образцы опухолевых очагов, одновременно содержащие мРНК трёх и более антигенов, отсутствовали. В образцах периферической крови тех же больных встречаемость мРНК SSX-1,2,4, XAGE-1, GAGE1-8 была ниже, чем в клетках опухолевых очагов, и она составила 15%, 9% и 3%, соответственно. Необходимо отметить присутствие в периферической крови мРНК PAGE-1 (12%) и NY-ESO-1 (9%), которые не были выявлены в клетках опухолевых очагов. 15% образцов периферической крови содержали мРНК одного антигена, 9% образцов – мРНК двух антигенов и 3% образцов – мРНК трёх антигенов. Ни один из образцов периферической крови не содержал мРНК более чем трёх антигенов. Следует отметить, что при сравнении экспрессии мРНК NY-ESO-1, SSX-1,2,4, XAGE-1, GAGE1-8 и PAGE-1 в периферической крови и клетках опухолевого очага одного больного в десяти случаях заболевания миомой матки в крови были обнаружены мРНК данных антигенов, которые не детектировались в клетках солидной опухоли.

Подобные различия в обнаружении мРНК тестированных антигенов в периферической крови и клетках опухолевых очагов могут быть обусловлены их функциональными отличиями, особенностями иммунного ответа, а также разнообразными эпигенетическими изменениями, происходящими при туморогенезе. Таким образом, при миоме матки мРНК XAGE-1, SSX-1,2,4, NY-ESO-1, PAGE-1 и GAGE1-8 выявляются как в крови, так и в клетках солидных опухолей. Обнаружение в периферической крови больных миомой матки мРНК раковотестикулярных антигенов свидетельствует о циркуляции в ней или опухолевых клеток, или продуктов их деградации.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» и Российского Фонда Фундаментальных Исследований.

СТРАТИФИКАЦИЯ ВОДНОЙ КОЛОНКИ ОЛИГОТРОФНОГО ОЗЕРА РАДОК, ВОСТОЧНАЯ АНТАРКТИДА, ПО ДОМИНИРУЮЩИМ БАКТЕРИАЛЬНЫМ ФИЛОТИПАМ ПО ДАННЫМ ПЦР С

ТРЕМЯ РАЗЛИЧНЫМИ ПРАЙМЕРНЫМИ КОМБИНАЦИЯМИ

–  –  –

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина, makondo07@gmail.com

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

Антарктические озёра – это уникальные экстремальные водные экосистемы c олиготрофными и низкотемпературными условиями существования. Изучение их микробиоты представляет особый интерес в плане поиска внеземной жизни (экзобиологии). Целью исследования было оценить микробное содержание и разнообразие в водной колонке холодного (не выше 1оС) олиготрофного пресноводного глубоководного оз. Радок, Оазис Эймери, Восточная Антарктида. Материал исследования включал 6 образцов, из которых 4 были взяты в самой глубокой точке озера (R1 – 1.3м; R100 – 100м; R200 – 200м; R367 – 367м) и 2 образца - у береговой черты и в истоке реки Межозёрной (глубина 2м). Для амплификации бактериальных генов 16S рРНК использовали геномную ДНК и праймеры на вариабельную область гена v3-v5 (для всех 6 образцов), а для двух образцов (R1 и R367) – дополнительно на вариабельную область v4-v8 и полноразмерный ген. Продукты реакций клонировали, клоны после риботипирования секвенировали и полученные последовательности анализировали филогенетически.

В результате для области v3-v5 в целом для 6 образцов доминировали (состояли из трёх и более клонов) 5 филотипов Actinobacteria, 2 филотипа Cyanobacteria совместно с хлоропластами и пластидами и по одному филотипу – -, -, -Proteobacteria, Bacteriodetes и Candidate division OD1. Особо отметим обширный видовой комплекс из актинобактерий, состоящий из трех подвидов, представители которых показали 96-97% сходства с видом Candidatus Planktophila limnetica и составили от 42 до 100% клонов во всех 6-х библиотеках.

Анализ бактериального разнообразия двух водных горизонтов (1м и 367м) по полноразмерному гену выявил 1 и 3 доминирующих филотипа, соответственно. Один филотип (хлоропластная ДНК водорослей) оказался общим и совпал с филотипом, выявленным для этих же образцов по области v3-v5, 2-ой филотип (367м, пластидная ДНК страменопилов) совпал с филотипом, выявленным по области v3-v5 лишь в образце с глубины 200м, а 3-й филотип (367м) из Bacteroidetes оказался уникальным. Вместе с тем, повсеместно доминирующий (по данным области v3-v5) видовой комплекс Candidatus Planktophila limnetica не был выявлен вовсе, что указывает на выраженную праймер-специфичность, которую необходимо учитывать при молекулярном анализе микробного разнообразия методом ПЦР амплификации генов 16S рРНК и последующего секвенирования.

Эту закономерность подтвердил анализ тех же водных горизонтов (1м и 367м) с праймерами на вариабельную область гена 16S рРНК v4-v8. Так, было выявлено 6 и 7 доминирующих филотипа, соответственно, из которых между образцами совпал лишь один (Mycobacterium sp.), который также совпал для области v3-v5, но не был выявлен вовсе при анализе полноразмерного гена. Кроме того, по данной области (v4-v8) было выявлено 4 (1м) и 3 (367м) уникальных филотипа, не совпадающих ни между собой, ни с филотипами, выявленными по области v3-v5 и полноразмерному гену.

В целом бактериальное разнообразие в водной колонке озера Радок оказалось на удивление большим и жизнь в нем, несмотря на экстремальные условия, процветает.

Данное исследование поддержано грантами РФФИ 07-04-00646_а, 05-05-66806-НЦНИ_a (С.А. Булат).

–  –  –

Князев Д.И.1, Сахарнова Т.А.2, Новиков Д.В.1, Алясова А.В.2,Новиков В.В.1.

Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского, Н.Новгород Нижегородская государственная медицинская академия, Н.Новгород ICAM-1 (InterCellular Adhesion Molecule 1) – мембранный гликопротеин молекулярной массой 80-114 кДа, принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов. ICAM-1 вовлечён в клеточные адгезивные контакты, а также в адгезивные контакты между клеткой и межклеточным матриксом. В соответствии с литературными данными, повышенная экспрессия ICAM-1 при раке может как подавлять развитие опухоли, так и способствовать агрессивному опухолевому росту и усилению метастатического потенциала. Помимо изменений экспрессии на поверхности малигнизированных клеток, наблюдаются изменения сывороточного уровня растворимого ICAMsICAM-1). Образование растворимой формы происходит либо за счёт схода с мембраны путём протеолитического расщепления, либо путём альтернативного сплайсинга матричной РНК (мРНК). В последнем случае удаляется участок пре-мРНК, кодирующий часть трансмембранного домена, в результате чего также происходит сдвиг рамки считывания и терминация трансляции.

В настоящей работе проведено исследование образцов опухолевых очагов толстого кишечника на наличие мРНК, кодирующих мембранную и растворимую формы ICAM-1; выполнена оценка содержания sICAM-1 в сыворотке крови больных колоректальным раком; проведено генотипирование больных по однонуклеотидному полиморфизму (SNP, single nucleotide polymorphism) rs5498 – замене аденина на гуанин, приводящего к аминокислотной замене лизин-глутамин в составе трансмембранного домена ICAM-1.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

В исследование было включено 49 больных колоректальным раком в возрасте от 45 до 84 лет на разных стадиях патологии. Детекцию мРНК мембранной и растворимой форм ICAM-1 в образцах опухолей проводили методом ОТ-ПЦР. Генотипирование по SNP rs5498 выполняли методами ПЦР и секвенирования. Определение уровня растворимого ICAM-1 в сыворотке крови выполняли двухсайтовым иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител ИКО-184, специфичных к ICAM-1, и поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток крови человека.

Распределение генотипов по SNP rs5498 было следующим: AA-33%, AG-49%, GG-18%, частота аллеля A составила 57%, G – 43%. Полученные результаты соответствуют ранее обубликованным данным европейских исследователей, однако на данный момент не позволяют сделать вывод о статистически значимой связи между генотипом по SNP rs4598 и риском развития колоректального рака.

Уровень растворимого ICAM-1 в сыворотке крови больных был вдвое выше, чем у доноров, независимо от присутствия мРНК ICAM-1 в клетках опухолевых очагов. Матричная РНК мембранной формы ICAM-1 наблюдалась в 84% случаев, из них в 34% случаев обнаруживалась мРНК растворимой формы. Случаев экспрессии мРНК только растворимой формы в опухолевых очагах не наблюдалось. У больных без метастазов мРНК растворимой формы выявлялась в 35% случаев, тогда как у больных с регионарными и отдалёнными метастазами – в 13% случаев. Таким образом, можно предположить, что наличие растворимой формы мРНК ICAM-1 ассоциировано с пониженным риском возникновения метастазов.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE ПО ОБРАЗОВАНИЮ ЖГУТИКОВ, СОЦИАЛЬНОЙ ПОДВИЖНОСТИ И СТРУКТУРЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ

ПОЛИСАХАРИДОВ

Ковтунов Е.А.1,2, Петрова Л.П.1, Шелудько А.В.1, Кацы Е.И.1 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, kovtunovea@mail.ru В качестве основного объекта исследования нами выбраны почвенные бактерии Azospirillum brasilense, обладающие гибким метаболизмом и способные вступать во взаимовыгодные ассоциативные взаимоотношения с широким кругом растений. На клетках A. brasilense могут образовываться разнообразные двигательные органеллы, с помощью которых, а также полисахаридных компонентов клеточной поверхности и иных средств межклеточной коммуникации и микромодификации внешней среды, азоспириллы заселяют новые территории и корни растений. Одним из способов колонизации поверхностей является роение бактерий, то есть зависящее от работы жгутиков, межклеточных контактов и продукции сурфактантов, роль которых могут выполнять липополисахариды (ЛПС) и экзополисахариды (ЭПС), согласованное перемещение по различным средам. При переходе от свободного плавания к роению увеличиваются продольные размеры бактерий и количество жгутиков. У A. brasilense, бактерий со смешанным жгутикованием, при роении, кроме полярного жгутика, образуются также многочисленные латеральные жгутики. Генетические механизмы, обеспечивающие переход бактерий от плавания к роению, до сих пор не расшифрованы. Ранее нами были получены неподвижные (с парализованным полярным и латеральными жгутиками) омегоновые мутанты модельного штамма A.brasilense Sp245. Интересно, что локусы, существенные для образования и работы жгутиков азоспирилл, обнаружены в резидентных плазмидах (р120 и р85) штамма Sp245. Целью данной работы было обогащение библиотеки мутантов A. brasilense Sp245 новыми инсерционными мутантами по образованию жгутиков, социальной подвижности, структуре R ЛПС и ЭПС. В качестве искусственного транспозона использовали Omegon-Km. Было отобрано 1714 Km клонов. Для отбора мутантов с нарушениями подвижности использовали метод укола в полужидкий агар, с дальнейшей регистрацией образования "колец роения". Наличие кольца "роения'' и его диаметр отражают подвижность в полужидкой среде, где преимущественную роль играют латеральные жгутики. Способность мутантов продуцировать функционирующий полярный жгутик оценивали по подвижности клеток в жидкой питательной среде посредством световой микроскопии. Затем клетки неподвижных клонов проанализировали с использованием просвечивающей электронной микроскопии. В результате были отобраны четыре полностью неподвижных мутанта. Штамм A. brasilense Sp245 на поверхности плотных питательных сред образует плотные, шероховатые, врастающие в агар, колонии (R-фенотип), активно сорбирующие краситель конго красный за счет R поверхностных полисахаридов. Количество Km клонов, не собирующих краситель, составляет примерно 30% от общего числа клонов; 40% клонов представлены неоднородной популяцией микроорганизмов: только часть их колоний активно сорбируют краситель. Были отобраны два мутанта, имеющие ослизненный S-фенотип, один из которых неподвижен. Обогащенная библиотека мутантов будет использована для клонирования и сек

<

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

венирования генетических локусов, мутагенез которых приводит к определенным изменениям в фенотипе бактерий; для идентификации кодирующих последовательностей и характеристики предполагаемых продуктов их трансляции. Выполнение этой работы должно способствовать получению новых данных о регуляции социальной подвижности микроорганизмов.

ВЛИЯНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В РИБОСОМНЫХ БЕЛКАХ L5 И L25 НА СВОЙСТВА АППАРАТА ТРАНСЛЯЦИИ И РОСТ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI

–  –  –

5S рРНК является неотъемлемым компонентом рибосом всех известных организмов. Как и в других бактериях, в Escherichia coli с этой рибосомной РНК образуют специфический комплекс три рибосомных белка, L5, L18 и L25. 5S рРНК-белковый комплекс расположен вблизи от функциональных центров 50S субчастицы, а рибосомная субчастица, реконструированная in vitro в отсутствие 5S рРНК, функционально неактивна. Однако до сих пор нет прямых данных о том, какую роль играют 5S рРНК или связывающиеся с ней белки в работе аппарата трансляции. Недавно нами показано, что два 5S рРНК-связывающих белка, L5 и L18, строго необходимы для выживания бактериальной клетки. В то же время, клетки E. coli, лишенные белка L25, выживали, но росли значительно медленнее клеток дикого типа. Целью данной работы является выяснение необходимости некоторых межмолекулярных контактов белков L5 и L25 для функционирования рибосомы.

Белок L5 в рибосоме помимо специфического взаимодействия с 5S рРНК и 23S рРНК контактирует еще с несколькими молекулами. В частотности, в кристаллической структуре функционального комплекса бактериальной рибосомы петля b2-b3 белка L5 образует контакт с тРНК в Р-участке.

Для выяснения роли этого структурного элемента белка L5 в работе рибосомы E. coli, мы внесли несколько вариантов мутаций непосредственно в хромосомный ген белка. Одиночные замены S73A и R80A в петле b2-b3 белка L5 не влияли на ростовые характеристики клеток E. coli. В то время как делеция всех аминокислотных остатков петли (S73-R80) приводила к замедлению роста клеток. Рибосомы, содержащие такой мутантный белок, не отличались от контрольных рибосом по компактности, белковому составу и точности трансляции природной матрицы in vivo. Однако эффективность синтеза полипептида (beta-галактозидазы) мутантными рибосомами была значительно сниженной.

По результатам биохимических и кристаллографических исследований белок L25 взаимодействует в рибосоме только с двумя молекулами, 5S рРНК и белком L16. Ранее нами было показано, что некоторые мутантные формы белка L25 (Y31A или H88F) неспособны связываться с изолированной 5S рРНК. Мы решили проверить, как такие мутации в белке L25 повлияют на рост клеток E. coli и встраивание белка в рибосому in vivo. Были получены штаммы E. coli, содержащие в хромосоме ген указанной мутантной формы белка L25. Оказалось, что клетки данных мутантных штаммов не отличаются по скорости роста от штамма дикого типа при различных условиях культивирования, а мутантный белок L25 встраивается в рибосому. Вероятно, что эти одиночные мутации в РНК-связывающем модуле белка L25 не полностью исключают его контакт с 5S рРНК в рибосоме. Поэтому, нами были получены и охарактеризованы штаммы E. coli, содержащие в хромосоме ген мутантной формы белка L25 с множественными заменами в РНК-связывающем модуле, для которых должна была полностью исключаться возможность их контакта с 5S рРНК.

Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание роли двух 5S рРНК-связывающих белков в формировании и функционировании бактериальной рибосомы.

Работа поддержана: грантами РФФИ № 09-04-01747-а, № 08-04-00459-а, Программами Президента РФ по поддержке Ведущих научных школ (НШ-751.2008.4) и «Молекулярная и клеточная биология» РАН. Работа М.Б. Гарбер поддерживается грантом Медицинского Института Говарда Хьюза (HHMI 55005609).

ВЛИЯНИЕ ИОННОЙ СИЛЫ РАСТВОРИТЕЛЯ НА СКОРОСТЬ ФОРМИРОВАНИЯ КОМПЛЕКСА

РНК-БЕЛОК Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Сычева А.М, Тищенко С.В., Никонов С.В., Гарбер М.Б.

Учреждение Российской академии наук Институт Белка РАН, Пущино, zelle@rambler.ru

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

Для функционирования многих биологических систем важна способность белков специфически узнавать определенные участки на поверхности РНК, однако правила, по которым происходит это узнавание, слабо изучены.

Объектом наших исследований является двухдоменный рибосомный белок L1. Этот белок образует L1-выступ рибосомы, участвующий в высвобождении деацилированной тРНК из Е-сайта. Кроме того, он имеет специфический участок связывания на мРНК и осуществляет регуляцию собственного синтеза по принципу «обратной связи».

Ранее в нашей лаборатории были определены пространственные структуры белка L1 из нескольких организмов в свободном состоянии и в комплексе со специфическими фрагментами мРНК и рРНК. Анализ структурных данных выявил на поверхности домена I белка L1 структурно инвариантную область, состоящую из консервативных аминокислотных остатков, формирующих со специфическим участком на РНК консервативные недоступные для растворителя водородные связи. РНК-связывающие свойства белка исследовались методом поверхностного плазмонного резонанса, который позволяет наблюдать за взаимодействием молекул в реальном времени.

В данной работе исследовалось влияние ионной силы раствора на кинетику образования и распада комплексов с РНК, образованных как белком L1 дикого типа, так и его мутантными формами. Ионная сила устанавливалась путем изменения концентрации NaCl в диапазоне 0.15М – 0.7 М. Измерения показали, что константа скорости ассоциации белка и РНК уменьшается в среднем на два порядка, тогда как константа скорости диссоциации увеличивалась не более чем в 5 раз. Характер зависимости кинетических констант от плотности противоионов на поверхности белка позволяет оценить влияние электростатических взаимодействий на сродство белка и РНК и кинетику образования и распада их комплексов.

Работа финансировалась Программой поддержки ведущих научных школ Программой МКБ РАН, Федеральным агентством по науки и (НШ-4435.2010.4), инновации (ГК № 02.740.11.0295), грантом РФФИ.

СОЗДАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ МУШЕК DROSOPHILA MELANOGASTER МОДЕЛИРУЮЩИХ РАКОВЫЕ

ПЕРЕРОЖДЕНИЯ ТКАНИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА

В РАЗВИВАЮЩИХСЯ ФАСЕТОЧНЫХ ГЛАЗАХ.

–  –  –

Идентификации новых генов/белков, активность которых повышена или нарушена при различных патогенных состояниях - одно из востребованных направлений современной геномики и протеомики, и является фундаментальной научной проблемой, решение которой имеет огромное значение для современной молекулярной биологии, медицины и фармакологии. Существует множество различных технологий идентификации потенциальных мишеней. Одной из таких технологий, до сих пор используемой лишь ограниченно, является технология экспрессии потенциального белка-мишени в глазу плодовой мушки D.melanogaster.

Впервые предполагается настолько масштабная транформация D.melanogaster препаратом кДНК библиотеки.

Благодаря высокоэффективным методам трансформации предполагается осуществить несколько сотен тысяч иньекций и тем самым получить коллекцию трансформантов, содержащую все кДНК человеческой ткани.

Примеры успешного выявления или характеризации человеческих белков-мишеней с использованием дрозофилы немногочисленны. Одна из причин этого - имевшая место ранее низкая "пропускная способность" технологии создания трансгенных мух, тогда как современные методы трансгенеза позволяют достичь высочайшей эффективности трансформации дрозофил. Кроме того, не ясно a priori, какой человеческий белок следует экспрессировать в дрозофиле и каковы шансы получения фенотипа, оправдывающего затраченные усилия. Подход, предлагаемый нами, решает эти проблемы и превращает их в сильные стороны. Вектор, в который клонируется кДНК-библиотека, модифицируется таким образом, чтобы уже в поколении F1 идентифицировать не только факт встраивания чужеродной ДНК в геном дрозофилы, но и фенотип глаза при экспрессии человеческого трансгена. Устанавливаются индивидуальные трансгенные линии, дающие рыхлость при экспрессии в глазах.

Идентификация новых генов, вызывающих нарушение развития глаза D.melanogaster с помощью ПЦР и секвенирования. Используя стандартные методы определения нуклеотидной последовательности ДНК, новизна подхода заключается в масштабном подходе селекции линий на основе нарушения фенотипа, которые подвергаются анализу, что может позволить проанализировать все человеческие гены, экспрессия которых нарушает процесс органогенеза модельного организма D.melanogaster.

Большой научной ценностью будет обладать исчерпывающее знание от том, какие белки человека настолько консервативны и важны, что при экспрессии в организме, далеко расположенном от человека на эволюционной

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

лестнице, способны взаимодействовать с белками этого организма и нарушать нормальные процессы его органогенеза. Прикладная ценность такой коллекции видится в исчерпывающем списке всех возможных дрозофильных моделей человеческих патологий.

На данный момент нами получено порядка 500 линий мушек, гиперэкспрессирующих человеческие гены. Из них 3 линиии охарактеризовано как рыхлоглазые, экспрессирующиеся в них белки идентифицированы. Ведётся работа по выяснению их функции в канцерогенезе.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ КЛЕТОК ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫМИ

ФАКТОРАМИ

–  –  –

На сегодняшний день большое значение придается разработке методов генно-клеточной терапии различных заболеваний человека, таких как нейродегенеративные и сердечнососудистые заболевания, с использованием стволовых клеток. Для повышения эффективности клеточной терапии активно исследуются возможности применения генетически модифицированных стволовых клеток, экспрессирующих терапевтические гены. В качестве терапевтических генов нами были выбраны следующие нейротрофические факторы: VEGF и FGF2.

Целью работы является получение генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, экспрессирующих терапевтические гены VEGF и FGF2.

Материалы и методы. Клонирование генов VEGF и FGF2 в экспрессионные плазмидные вектора. Амплификация генов VEGF и FGF2 с использованием специфичных праймеров методом ОТ-ПЦР, созданных на основе нуклеотидных последовательностей данного гена из системы GeneBank. Продукты ПЦР – амплификации были проанализированы в агарозном геле с последующим выделением из геля и очищением интересующих нас фрагментов. Реакция лигирования полученных фрагментов была проведена с использованием T4 ДНК-лигазы.

Для исключения наличия мутаций и подтверждения получения рекомбинантных плазмид было проведено полное секвенирование вставок. Определение первичной нуклеотидной последовательности выполнялось на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). После этого нами было проведено субклонирование генов в экспрессионные плазмидные вектора pcDNА 3.1+ и pBudCE4.1. В качестве трансплантируемых клеток были использованы клетки мононуклеарной фракции пуповинной крови человека, характеризующиеся низкой аллореактивностью. Эти клетки были выделены с помощью стандартной методики осаждения клеток в плотности фиколла. Для трансфекции выделенных клеток плазмидой pBud-VEGF-FGF2 был выбран метод электропорации, обладающий высокой биологической безопасностью и эффективностью по сравнению с вирус-опосредованной и химической передачей гена. В работе использовался прибор Gene Pulser Xcell Total System с кюветами 0,4 см (BioRad). При повышении значений напряжения и емкости пульсового воздействия эффективность электропорации была выше, однако в то же время существенно снижалась жизнеспособность клеток (информация не показана). После трансфекции клетки инкубировались в CO2 –инкубаторе в течение 18 ч в среде RPMI1640, содержащей 10% FBS и ампициллин/стрептомицин. В качестве контроля послужили нетрансфецированные клетки мононуклеарной фракции и клетки, трансфецированные контрольной плазмидой pEGFP-N2 (Clontech).

Результаты. 1) получение плазмидного вектора, экспрессирующего комбинацию генов сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF и фактора роста фибробластов FGF2; 2) экспериментальным путем разработан протокол трансфекции стволовых клеток человека для научно-исследовательских работ и последующих клинических испытаний;3) путем трансфекции стволовых клеток получены генетически модифицированные клетки, экспрессирующие сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF и фактор роста фибробластов FGF2.

ИССЛЕДОВАНИЕ ХИТИН-СПЕЦИФИЧНОГО ДОМЕНА РАСТИТЕЛЬНЫХ ПЕРОКСИДАЗ

–  –  –

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

В настоящее время ответ на вопрос о роли генов устойчивости растений неблагоприятным условиям среды, в том числе биотической природы, является актуальным, так как это открывает перспективы использования биотехнологических подходов для повышения продуктивности растений. Дикие виды пшениц и эгилопсов с многообразием морфо-физиологических и биохимических признаков, характеризуются разнообразием и в генах, способствующих формированию у них и устойчивости ко многим биотическим и абиотическим факторам. Среди многообразия таких генов специфическое место занимают гены, кодирующие патоген-индуцируемые изопероксидазы, среди которых ранее в нашей лаборатории выявлены хитин-специфичные изоформы. Целью этой работы явился анализ молекулярно-генетической организации полисахарид-специфичного сайта гена пероксидаз растений.

Проведенная нами ПЦР с использованием праймеров к фрагменту гена, кодирующего полисахаридспецифичномый домен, показал, что между видами пшеницы значительных отличий по размеру ампликона не существует. В то же время, секвенирование показало наличие в этом фрагменте определенных замен нуклеотидов, специфичных к определенным видам пшеницы. Полученные данные можно рассмотреть с позиции эволюции пшеницы.

C использованием вектора pCambia 1305.1 с репортерным геном GUS, находящегося под контролем 35S промотора, для направленного клонирования фрагмента хитин-связывающего сайта гена анионной пероксидазы получена генно-инженерная конструкция. Следует заметить, что амплифицированный фрагмент встроен вместо интрона, идущего после промотора гена GUS. После таких модификаций данная конструкция была способна экспрессироваться в бактериальных клетках. Проведенный SDS-форез выявил белок размером ~ 110 кДа, который, по нашему предположению, и является трансформированным химерным белком. Соответственно, интерес представлял факт определения его способности взаимодействовать с хитином. С использованием хитина в качестве сорбирующей матрицы экспериментально доказано, что химерный белок -глюкуронидазы, содержащий хитин-связывающий домен пероксидазы, обладает способностью взаимодействовать с хитином.

На основе вектора pCAMBIA 2301 с фрагментом гена анионной пероксидазы в антисенс-ориентации под управлением промотора вируса мозаики георгина создана генно-инженерная конструкция. Полученные конструкции в сенс- и антисенс-ориентациях методом агробактериальной трансформации встроены в каллусы пшеницы и арабидопсиса. Это позволит выяснить роль пероксидазы в механизмах защитных реакций против патогенов.

Таким образом, в этой работе нам удалось доказать способность взаимодействовать с хитином фрагмента гена пероксидазы в химерной конструкции с геном -глюкуронидазы. Полученные данные доказывают, что у хитинспецифичных пероксидаз растений на поверхности белка существуют непосредственные сайты, ответственные за их связывание с хитином патогенных грибов.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №05-04-48310, 08-04-90259-Узб-а и Всероссийского молодежного научного инновационного конкурса «УМНИК» (2009).

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ НАСЕКОМЫХ ОТРЯДА ТАРАКАНОВЫХ (DICTYOPTERA,

BLATTINA): РИБОСОМНАЯ ДНК И МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ

–  –  –

Кластер рибосомных генов (рДНК) является классическим примером мультигенного семейства. Повторяющиеся единицы формируют кластер, в которых гены 18S-, 5,8S- и 28S-подобных рРНК разделены рядом спейсерных последовательностей: межгенными (IGS) и внутренними транскрибируемыми (ITS-1 и ITS-2) спейсерами.

Известно, что одной из важных составляющих генома эукариот являются мобильные генетические элементы (МГЭ). Доля генома, приходящаяся на мобильные элементы может составлять десятки процентов. У многих видов эукариот кластеры рибосомных генов служат, так называемой, «нишей» для определенных семейств мобильных элементов, в частности, R1 и R2 ретропозонов, которые интегрируются в высококонсервативный район 28S гена.

В ходе работы был проведен сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов фрагментов 18S-5,8SS рДНК 38 видов трех семейств тараканов. Показано, что данный фрагмент является высокоинформативным для филогении данной группы насекомых. Построены филогенетические деревья на основе как относительно эволюционно консервативных частей генома (гены рибосомных РНК), так и относительно вариабельных – промежуточных последовательностей (спейсеров), разделяющих повторяющиеся последовательности структурных генов. Первый подход направлен на создание филогенетического древа, позволяющего определить степень эво

<

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

люционного родства между различными таксонами. Второй подход, предполагающий анализ близкородственных видов, направлен на выявление особенностей конкретных механизмов молекулярно-эволюционного процесса изменчивости рДНК этой группы организмов.

Построение филогенетического древа отряда Таракановые позволяет выявить закономерности эволюционной изменчивости организмов и определить генетические дистанции между различными видами, то есть позволяет проследить этапы «вертикального переноса» генетического материала. Кроме того, построение филогенетических деревьев необычайно важно для выявления актов «горизонтального переноса» различных участков генома, в частности мобильных элементов.

С использованием нескольких пар вырожденных праймеров нами были амплифицированы и затем клонированы протяженные фрагменты R2 мобильных элементов нескольких видов тараканов, принадлежащих различным подсемействам. Для R2 ретропозона рыжего таракана определена полная последовательность нуклеотидов.

Исследована доменная организация белковых последовательностей, соответствующих выявленным ORF клонированных мобильных элементов.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (09-04-01113-а и 08-04-01402-а) и Программы фундаментальных исследований РАН «Биологическое разнообразие» (подпрограмма «Генофонды и генетическое разнообразие»).

МЕХАНИЗМЫ СОХРАНЕНИЯ ПЛОДА – РОЛЬ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК

–  –  –

В ходе беременности в организме матери происходят уникальные иммунологические изменения, позволяющие успешно развиться плоду, несущему 50% генов отца, чуждых для матери. Очевидно, должны существовать специфические механизмы для поддержания толерантности матери к растущему плоду, и их изучение является принципиальной задачей, так как большое число патологий беременности (бесплодие, невынашивание, преэкламсия) являются следствием иммунологического конфликта на границе разделов организмов матери и плода.

Данная работа посвящена исследованию роли наиболее активных антигенпрезентирующих клеток иммунной системы - дендритных клеток (ДК) в реализации механизмов, обеспечивающих толерантность иммунной системы матери и плода. В ходе работы была in vitro создана экспериментальная модель фето-плацентарного микроокружения, включающая основные клеточные типы беременной матки: клетки цитотрофобласта, дендритные клетки, лимфоциты и, в ряде экспериментов, децидуальные фибробласты. ДК получали из моноцитов крови культивированием с интерлейкином-4 и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором.

Часть ДК созревала в присутствии клеток цитотрофобласта (ТР). Культуры ДК, росшие с ТР (ДК-ТР), содержали большое количество вытянутых веретенообразных клеток, в отличие от ДК, росших без ТР. Культуры ДКТР демонстрировали фенотипическую незрелость – снижение экспрессии молекул HLA-DR и процента клеток, несущих ее, повышение экспрессии моноцитарного маркера CD14. ДК, росшие без ТР, как и ДК-ТР, одинаково эффективно стимулировали пролиферацию аллогенных лимфоцитов. В то же время созревание ДК в присутствии ТР подавляло их способность стимулировать продукцию интерферона- – ключевого цитокина, управляющего наиболее опасными для плода клеточными формами иммунных реакций. Т-лимфоциты, стимулированные ДК-ТР, сохраняют экспрессию CD62L, что ограничивает маршрут их рециркуляции и возможность участия в конфликте матери и плода. Таким образом показано, что ДК участвуют в формировании цитокинового сдвига беременности и изменении миграции Т-клеток. Полученные данные открывают возможность поиска новых средств для лечения патологий беременности. Работа поддержана РФФИ, проекты 07-04-00244, 10-04-00304-а.

БОКОВОЙ L12-ВЫСТУП АРХЕЙНОЙ РИБОСОМЫ: КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСА

N-КОНЦЕВОГО ФРАГМЕНТА БЕЛКА L10 СО СПЕЦИФИЧЕСКИМ ФРАГМЕНТОМ 23S рРНК

–  –  –

Белки L10 и L12 вместе с доменом II 23S рРНК формируют необходимый морфологический элемент большой рибосомной субчастицы всех изученных организмов, называемый выступом (L7/L12-выступ в бактериях, L12выступ в археях, P1/P2-выступ в эукариотах). L12-выступ вовлечен в образование так называемого "ГТФазусвязывающего сайта" и играет важную роль при взаимодействии рибосомы с факторами трансляции и в контроле точности трансляции.

Наша работа посвящена структурным исследованиям компонентов рибосомного L12-выступа из архей рода Methanococcus. Из-за высокой подвижности данного выступа его кристаллическая структура до сих пор полностью не определена в составе рибосомы. Поэтому определение структур отдельных компонентов данного выступа является актуальной задачей. Знание пространственной структуры комплекса рибосомного белка L10 со специфическим фрагментом 23S рРНК позволит уточнить структуру архейной рибосомы и детально оценить взаимодействие между белком L10 и 23S рРНК.

В препаративных количествах наработан и выделен рекомбинантный N-концевой фрагмент рибосомного белка L10 из Methanococcus jannaschii с чистотой пригодной для кристаллизации. Специфический 95 нуклеотидный фрагмент 23S рРНК из M. jannaschii синтезирован методом транскрипции in vitro. N-концевой фрагмент рибосомного белка L10 формирует комплекс со специфическим фрагментом 23S рРНК в молярном соотношении 1:1. Оказалось, что в процессе кристаллизации от 95 нт фрагмента 23S рРНК отщепляется несколько нуклеотидов. Именно из такого препарата данного РНК-белкового комплекса были получены первые кристаллы. Было принято решение создать генетическую конструкцию укороченного специфического фрагмента 23S рРНК.

Фрагмент гена 23S рРНК был наработан с помощью ПЦР и вставлен в вектор pUC18. Отсутствие мутаций в нуклеотидной последовательности фрагмента гена 23S рРНК в созданной плазмиде было проверено секвенированием.

Работа финансировалась Программой МКБ РАН и Федеральным агентством по науке и инновации (ГК № 02.740.11.0295).

ВЛИЯНИЕ ИНДУКЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК В КЛЕТКАХ К562 НА ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ

МОДИФИКАЦИИ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАСОМ.

–  –  –

Учреждение российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, t.n.moiseeva@gmail.com Протеасома представляет собой мультисубъединичный белковый комплекс, который отвечает за расщепление большинства внутриклеточных белков по средствам убиквитин-зависимого протеолиза. Кроме того, известно, что протеасомы обладают неканоническими активностями – эндорибонуклеазной и АТФ-зависимой геликазной, а также участвуют в регуляции транскрипции. Совмещение таких важных функций делает протеасому незаменимым участником различных этапов регуляции экспрессии генов при любом изменении физиологического состояния клетки.

Доксорубицин является сертифицированным противораковым препаратом, поэтому исследование его воздействия на клетки и, в частности, на активности и посттрансляционные модификации протеасом, имеет важнейшее прикладное значение.

Для изучения влияния индукции повреждения ДНК в клетках К562 на посттрансляционные модификации, субъединицы протеасом, выделенных из цитоплазмы и ядер контрольных и обработанных доксорубицином клеток К562, были разделены с помощью двумерного электрофореза. Пятна, соответствующие по расположению на геле альфа-субъединицам протеасомы, были вырезаны из геля и исследованы с помощью массспектрометрии на наличие посттрансляционных модификаций. Удалось выявить несколько сайтов фосфорилирования и убиквитилирования субъединиц 5, 6 и 7, при этом количество модификаций изменялось после воздействия на клетки доксорубицина.

Исследование эндорибонуклеазных активностей тех же субъединиц показало существенные изменения в предпочтительных условиях проведения реакции эндонуклеолиза при индукции повреждений ДНК.

Для оценки влияния доксорубицина на протеолитические активности протеасом были проведены эксперименты с флуорогенными пептидными субстратами для проверки трипсин-подобной, химотрипсин-подобной и каспазподобной активностей протеасом. Все эти активности оказались существенно выше для протеасом, выделенных из клеток, обработанных доксорубицином.

Полученные результаты говорят о возможной регуляции каталитических активностей протеасомы – эндорибонуклеазной и пептидазных – с помощью таких посттрансляционных модификаций – фосфорилирования и убиквитилирования.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (проекты №08-04-00834 и №10-04-01234) и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

–  –  –

Hfq – небольшие (от 8 до 11 кДа) термостабильные бактериальные белки, являющиеся регуляторами экспрессии многих генов. Мутация hfq- в клетках Escherichia coli приводит к изменению экспрессии генов более чем 30 белков, как правило, за счет стимулирования связывания малых регуляторных РНК с комплементарными участками мРНК, что позволяет инициировать или ингибировать их трансляцию.

Характерной чертой бактериальных Sm-подобных белков Hfq является так называемый Sm-фолд, состоящий из консервативных Sm1 и Sm2 мотивов. В клетке такие белки существуют в виде гексамеров и образуют тороидальные структуры. За взаимодействие с молекулами РНК, как правило, отвечают атомы -тяжей Sm1-мотива, а за формирование четвертичной структуры - атомы азота и кислорода главной цепи 4 и 5 тяжей Sm2-мотива соседних мономеров, которые образуют консервативные водородные связи и формируют сквозной -лист, проходящий через весь гексамер. Стабилизация четвертичной структуры обеспечивается взаимодействием боковых цепей консервативных боковых остатков, которые прикрывают межсубъединичную область от растворителя.

Нами было высказано предположение, что замена ряда консервативных аминокислотных остатков, отвечающих за формирование четвертичной структуры, могут привести к утрате важных консервативных водородных связей. Это, в свою очередь, может привести к изменению четвертичной структуры белка, либо уменьшению стабильности белка Hfq.

Были получены мутантные формы белка с заменой выбранных консервативных аминокислотных остатков, часть из них закристаллизованы. Полученные белки обладали пониженной стабильностью по сравнению с белком дикого типа. С кристаллов белков сняты наборы рентгеноструктурных данных высокого разрешения. Определение структур мутантных форм белков позволит нам оценить влияние мутаций на характер образования водородных связей и формирование четвертичной структуры белка Hfq.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы МКБ РАН и Федеральным агентством по науке и инновации (ГК №02.740.11.0295).

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА ЭКТОИНА У АЭРОБНЫХ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

–  –  –

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина, Пущино, mii80@rambler.ru Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности ДНК выше ectABC-ask оперона, кодирующего ферменты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, Methylophaga alcalica и Methylophaga thalassica, выявили ОРС (гены ectR), продукты которых проявляли сходство с известными транскрипционными регуляторами Mar-семейства. У Mm. alcaliphilum 20Z и M. thalassica ectABCask оперон транскрибируются с двух промоторов (ectAр1 и ectAр2), проявляющих гомологию с 70-зависимым промотором Escherichia coli. Показано, что количество мРНК, транскрибируемой с промотора ectAр1, максимально в клетках, подвергнутых осмотическому шоку, и минимально у выросших при низкой концентрации соли клеток, тогда как транскрипция с промотора ectAр2 поддерживалась в этих условиях на постоянном уровне. Таким образом, из двух промоторов ectABC-ask оперона только промотор ectAр1 является осморегулируемым.

Для выяснения роли обнаруженного нами белка EctR в регуляции ect-оперона был получен штамм Mm. alcaliphilum 20Z с делецией гена ectR. Уровень экспрессии генов биосинтеза эктоина определяли в клетках исходного и мутантного штаммов с использованием репортерного гена gfp, клонированного в векторе pTSGex под контролем промотора ect-генов (ectAp). Измерение флуоресценции показало более высокую активность ectAp промотора в штамме с нокаутом гена ectR при росте на средах с различной соленостью, по сравнению со штам

<

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

мом дикого типа. Следовательно, у данного метанотрофа белок EctR является репрессором транскрипции ectоперона.

Показано, что у Mm. alcaliphilum 20Z транскрипция гена ectR осуществляется с единственного промотора ectRp, проявляющего сходство с 70-зависимым промотором E. coli. Следует отметить, что у Mm. alcaliphilum 20Z промотор ectRp находится между промоторами ectAр1 и ectAр2, свидетельствуя о том, что транскрипция с промотора ectRp может контролироваться собственным продуктом - белком EctR. Напротив, у M. thalassica транскрипция гена ectR осуществляется с трех промоторов, причем предполагаемые -10 и -35 последовательности только промотора ectRp1 гомологичны соответствующим последовательностям 70-зависимого промотора E.

coli. При этом промоторы ectRp1, ectRp2 и ectRp3 гена ectR не перекрываются с промоторной областью ectоперона, в промоторных областях гена ectR не найден сайт связывания для белка EctR. Вероятно, транскрипция гена ectR у M. thalassica осуществляется конститутивно, но на низком уровне.

Картированием сайта узнавания белка с помощью ДНКазы I установлено, что EctR Mm. alcaliphilum 20Z защищает протяженный асимметричный участок ДНК, содержащий -10 последовательность ectAр1 промотора. Гельфильтрацией показано, что данный белок как в свободном (м. м.

44-45 кДа), так и в связанном с ДНК состоянии (м. м. 50-55 кДа) является димером. Поиск в базе данных GenBank ОРС, гомологичных генам ectR, выявил их присутствие в нескольких геномах галофильных бактерий. Последовательности, аналогичные сайту связывания белка EctR выявлены в участках ДНК, фланкирующих гены синтеза эктоина у M. thalassica, M. alcalica, Reinekea sp. и Oceanobacter sp. Полученные данные позволяют предположить у ряда галофильных бактерий наличие регуляторной системы экспрессии генов синтеза эктоина с участием транскрипционного репрессора EctR.

Работа поддержана грантами РФФИ (10-04-01224-а; 09-04-92520-ИК_а), Министерства образования и науки РФ (РНП 2.1.1/605), ГК (02.740.11.1296) и CRDF (Rub1-2946-PU-09).

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭВОЛЮЦИИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ОСНОВНОГО

АНТИГЕННОГО БЕЛКА БАКТЕРИОФАГА Т4.

–  –  –

Бактериофаг Т4 и родственные ему Myoviridae несут на поверхности своего капсида декорирующие белки. Исследуемый белок hoc является одним из них, и его влияние на жизнеспособность фага ничтожно. Тем не менее, именно этот белковый компонент фаговой частицы вызывает наибольший иммунный ответ в организме животного. Учитывая тот факт, что бактериофаги обнаруживаются в крови животного организма, то можно предположить, что отбор вариантов поверхностных белков капсида мог происходить в этой экологической нише. Белок hoc состоит из четырех сходных между собой доменов. Исследование аминокислотной последовательности каждого из этих доменов белка hoc бактериофага Т4 проводилось с помощью программы PSI-BLAST. Для изучения аминокислотной последовательности исследуемого белка, мы провели пять последовательных повторов (итераций). В каждом выданном программой результате обнаруживались домены белков капсида родственных бактериофагов, степень сходства с которыми была высока, а также домены других белков фагов, бактерий и животных. Все эти последовательности мы вводили в следующий этап повтора, в котором появлялись новые сходные с доменами Gp hoc участки различных белков. Проведенное нами сравнительное исследование этого белка с его гомологами родственных бактериофагов показало, что он обладает большой эволюционной пластичностью. В основном его изменения связаны с изменением числа повторяющихся аминокислотных последовательностей. Выводы. 1).В сравнении отдельных доменов было найдено сходство с соответствующими доменами белков hoc родственных бактериофагов и в меньшей степени сходство с их другими доменами.

2).Несмотря на то, что четыре домена исследуемого белка сходны между собой, их последовательности показали сходство с различными белковыми последовательностями. 3).Исследование первого домена показало, что его аминокислотная последовательность имеет также слабое сходство с белками отростков бактериофага VP5, относящегося к Рodoviridae, а также BP-4795 семейства Siphoviridae. В ходе изучения особенностей второго домена было обнаружено его некоторое сходство с капсидным белком фага VP2 (Рodoviridae) и белком Wac бактериофага RB43. Последний входит в состав воротничка фага. Мы предполагаем, что данные последовательности белков могут быть экспонированы на поверхности частиц. Второй домен hoc обнаруживает интересное сходство с компонентом отростка различных бактериофагов (Felix 01 семейства Myoviridae, инфицирующий Salmonella, лямбдоподобный фаг Enterobacteria phage HK97, относящийся к Siphoviridae, а также с основным белком хвоста профагов бактерий Shigella boydii, Escherichia coli O157). В этом сравнении также показано сходство белка hoc Т4 и капсидного белка фага Т5. Второй домен обнаруживает большое сходство с двумя участками по 94 аминокислоты в белковой последовательности Gp hoc бактериофага RB30. Этот факт

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

дает основание полагать, что эволюционно белок фага RB30 стал пятидоменным в результате дупликации участка гена hoc фага Т4. Исследование третьего домена показало наибольшее сходство белков hoc у семи родственных бактериофагов: RB32, RB14, RB51, RB30, RB69,JS10, JS98. Домены этих фагов различаются между собой многочисленными заменами в области последних 20 аминокислот. Также в списке подобных белков обнаруживается отмеченный ранее белок компонента хвоста бактериофага VP5. Показано слабое сходство с Gp hoc фага Phi1. Сравнение четвертого домена hoc фага Т4 показало, что, по-видимому, именно эта часть белка постоянна во всех белках hoc родственных бактериофагов. Данная последовательность совпадает на 97% у 14 бактериофагов Т4-типа. Четвертый домен имеет большое сходство с белком hoc фага RB43, который не обнаруживал сходство с первыми тремя доменами данного белка. Вероятно, прикрепление к капсиду происходит именно за счет четвертого домена и его присутствие для формирования структуры белка обязательно. 4) Мы предполагаем, что природные hoc- - мутанты и фаги, сходные по гену hoc с RB43, могут быть более эффективными в фаготерапии заболеваний, вызванных патогенными бактериями, в связи со слабым антительным ответом на них иммунной системой человека или животного.

ГЕТЕРОТРИМЕРНЫЙ ФАКТОР ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2:

СТРУКТУРА ВТОРОГО САЙТА СВЯЗЫВАНИЯ ГТФ

Никонов О.С., Столбоушкина Е.А., Архипова В.И., Никонов С.В., Гарбер М.Б.

–  –  –

Гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 (e/aIF2) играет центральную роль в связывании метианилированной инициаторной тРНК (Met-tRNAi) на рибосоме в эукариотах и археях. В комплексе с ГТФ он связывается с такой тРНК и доставляет ее в Р-сайт малой рибосомной субчастицы.

Так же как и его эукариотический гомолог, архейный фактор инициации трансляции состоит из трех субъединиц:,, и. Анализ кристаллической структуры, полученной нами ранее сокристаллизацией субъединицы aIF2 со смесью ГДФ и нерасщепляемого аналога ГТФ позволил выявить второй сайт связывания нуклеотида на молекуле aIF2. В то время, как канонический сайт связывания, располагающийся на G-домене, был занят молекулой ГДФ, второй сайт, расположенный на поверхности домена 2, был занят молекулой GDPNP. Однако, связывание нерасщепляемого аналога ГТФ в этом месте могло быть обусловлено как кристаллическими условиями, так и особенностями данного нерасщепляемого аналога, содержащего NH группу перед -фосфатом, которая образовывала водородную связь с кислородом главной цепи Asp222. Т.о. функциональная значимость обнаруженного второго места связывания нуклеотида на субъединице aIF2 оставалась под вопросом. Нашими австрийскими коллегами, in vitro и in vivo было показано, что субъединица aIF2 из Sulfolobus solfataricus имеет дополнительную функцию. Она связывается с 5’-концом мРНК при наличии на нем трифосфата и защищает ее от деградации. Мы предположили что обнаруженный нами второй сайт связывания нуклеотида может так же принимать участие и в связывании мРНК. Нами были получены кристаллы и определена структура комплекса aIF2 из S. Solfataricus с другим нерасщепляемым аналогом ГТФ, а именно GDPCP, не содержащим NH группу в положении перед гамма фосфатом, и, следовательно, не способным образовать водородную связь в этом положении. Сравнение положений обоих нерасщепляемых аналогов ГТФ по отношению к субъединице показало, что второй сайт связывания нуклеотида действительно существует на поверхности aIF2 и что он способен связывать различные аналоги ГТФ сходным образом. Как и в структуре, полученной сокристаллизацией aIF2 со смесью GDPNP/GDP, в структуре комплекса aIF2-GDPCP была обнаружена молекула нерасщепляемого аналога ГТФ в щели, сформированной -листом домена II (7, 8, 12, 13) и мобильным участком switch 1 Gдомена (остатки 41-44). Участок структуры, формирующий второй сайт связывания нуклеотида на поверхности субъединицы, образован консервативными и высоко консервативными остатками, как в археях, так и в эукариотах, часть которых образует сеть водородных связей с нерасщепляемым аналогом ГТФ.

Работа поддержана РФФИ, Программой поддержки ведущих научных школ и Программой МКБ РАН.

–  –  –

Рибосомный белок L1 – один из самых крупных рибосомных белков, он образует L1-выступ рибосомы, участвующий в высвобождении деацилированной тРНК из Е-сайта. Кроме того, он имеет специфический участок связывания на мРНК и осуществляет регуляцию собственного синтеза по принципу «обратной связи».

В нашей лаборатории давно ведётся работа по исследованию структуры и РНК-связывающих свойств белка L1.

Ранее нами были определены структуры рибосомного белка L1 из различных организмов как в свободном, так и в связанном с РНК состояниях. Нами было обнаружено, что взаимное расположение доменов в бактериальном белке L1 из Thermus thermophilus (TthL1) меняется при связывании с РНК; белок переходит из закрытой конформации в открытую. В гомологичных белках L1 из термофильных архей закрытая конформация не наблюдалась. Анализ аминокислотных последовательностей и структур бактериального и архейных белков позволил предположить, что закрытая конформация TthL1 в свободном состоянии вызвана присутствием в его междоменной перетяжке дополнительного остатка Ala158, который отсутствует в архейных белках L1.

Нами была получена мутантная форма белка L1 из бактерии T. thermophilus с делецией аланина в данном положении. Белок был закристаллизован, пространственная структура определена методом молекулярного замещения с разрешением 1.95. Анализ полученных данных показал, что делеция аланина в междоменной перетяжке белка привела к расхождению доменов белка, а также к повороту второго домена относительно первого. Белок TthL1из закрытой конформации перешел в открытую, характерную для него в составе комплекса с РНК.

Несмотря на такие серьёзные конформационные подвижки, РНК-связывающие свойства белка изменились незначительно. На приборе ProteOn XPR36 были измерены константы скоростей ассоциации и диссоциации, характеризующие взаимодействия рибосомного белка L1 дикого типа и его мутантной формы со специфическими фрагментами рРНК и мРНК. Показано, что раскрытие доменов бактериального рибосомного белка L1 практически не изменило скорости формирования и распада его комплексов с РНК. Таким образом, перевод свободного белка TthL1 в открытую конформацию не влияет на кинетику формирования РНК-белковых комплексов.

Работа была поддержана Программой поддержки ведущих научных школ (НШ-4435.2010.4), Программой МКБ РАН, Федеральным агентством по науки и инновации (ГК № 02.740.11.0295), грантом РФФИ (10-04-00618-а).

МЕТОД ОДНОВРЕМЕННОЙ ДЕТЕКЦИИ ДВУХ ФОРМ мРНК АЛЬФА-ЦЕПИ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 В КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕВЫХ ОЧАГОВ

–  –  –

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского, г. Н.Новгород, mar_mot@list.ru Задачи исследования. Важную роль в механизмах активации и супрессии клеточного иммунного ответа играет альфа-цепь рецептора интерлейкина-2 (IL-2RA, CD25 антиген) – поверхностный белок клеток иммунной системы. Экспрессия CD25 антигена показана на злокачественно трансформированных клетках. Обнаружено, что IL-2RA участвует в механизмах пролиферации неопластических клеток, а высокий уровень экспрессии CD25 антигена на их поверхности коррелирует с плохим прогнозом для пациента. Показано, что в клетках наряду с мРНК, кодирующей полноразмерную форму CD25 антигена, может присутствовать альтернативная форма мРНК CD25 антигена с делецией 4-го экзона, ответственного за связывание IL-2 (CD25Exo4Del). Целью работы явилась разработка и апробация метода одновременной детекции полноразмерной и альтернативной форм мРНК CD25 антигена в клетках опухолевых очагов.

Материалы и методы. Исследовали 51 образец клеток опухолевых очагов больных колоректальным раком. Выделение мРНК из образцов проводили методом фенол-хлороформенной экстракции. Нуклеотидную последовательность кДНК определяли дидезоксинуклеотидным методом с помощью автоматического генетического анализатора ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer.

Результаты и выводы. Для разработки метода детекции мРНК CD25 антигена в клетках опухолевых очагов с использованием гнездового варианта ОТ-ПЦР сконструировали две пары праймеров, специфичных к последовательностям, соответствующим местам соединения экзонов мРНК. Для эффективной амплификации фрагментов кДНК гена IL-2RA эмпирически подобрали оптимальные значения параметров реакции: температуру и время отжига праймеров, концентрацию ионов Mg2+ в буфере для полимеразы. При установленном сочетании условий проведения ОТ-ПЦР на матрице мРНК, выделенной из клеток опухолевых очагов, обнаруживаются два вида кДНК гена IL-2RA: кДНК, кодирующая полноразмерный CD25 антиген и кДНК, кодирующая его альтернативную форму CD25Exo4Del. Тестирование образцов опухолевых очагов на присутствие мРНК CD25 ан

<

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

тигена с использованием разработанного метода показало, что совместное присутствие полноразмерной и альтернативной форм мРНК СD25 антигена в клетках опухолевых очагов больных колоректальным раком регистрируется в 92% случаев (47 из 51). В двух исследованных образцах была выявлена только полноразмерная форма мРНК CD25 антигена. В двух образцах не обнаружена ни одна форма мРНК CD25 антигена.

–  –  –

Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, olgunja_@mail.ru;

Явление горизонтального переноса генов широко известно у прокариот, как способ передачи генетической информации. Долгое время подвергалось сомнению участие генетического материала эукариот в горизонтальной передаче. На сегодняшний день известно, что представители рода Agrobacterium способны переносить и встраивать фрагмент своей плазмиды в ядерный геном растения. Это свойство агробактерий активно используется в генной инженерии для получения трансгенных организмов. Однако, около 30 лет назад было обнаружено, что некоторые нетрансформированные растения могут содержать в ядерном геноме последовательности, гомологичные участку агробактериальной плазмиды (Т-ДНК). Например, у ряда представителей рода Nicotiana были обнаружены последовательности, гомологичные Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes. Данные мотивы закрепились в растительном геноме в процессе эволюции, поскольку, вероятно, могли иметь некое важное значение для растения. В связи с этим представляется важной характеристика видов несущих вставку Т-ДНК, и видов, не имеющих подобных последовательностей по способности к регенерации и трансформации, поскольку, способность к трансформации и регенерационный потенциал растения, вероятно, могли повлиять на возможность закрепления последовательностей, гомологичных агробактериальной Т-ДНК, в геноме растения в процессе эволюции. Кроме того, вероятно, может существовать связь между присутствием Т-ДНК-подобных мотивов у растения и его способностью к трансформации и регенерации.

Нами была охарактеризованы Т-ДНК-содержащие виды: N.tabacum, N.gossei, N.suaveolens, и виды, не несущие Т-ДНК: N.rustica, N.langsdogffii. Способность растений к регенерации проверена на средах Мурасиге-Скуга с добавлением синтетических фитогормонов (нафтилуксусной кислоты и бензоаминопурина). Оценена способность к трансформации 6 штаммами агробактерий дикого типа Agrobacterium rhizogenes (15834, 8196, A4) и A.

tumefaciens (T37, C58, A6).

Для всех видов показана высокая регенерационная способность с преимущественным проявлением определенных морфогенетических реакций. Необходимо отметить, что у ряда Т-ДНК содержащих видов проявление морфогенетических реакций было сходным.

Оценена способность к агротрансформации. Часть видов продемонстрировали высокую способность к трансформации, часть представителей – низкую. Как и в случае регенерационной способности, виды характеризовались проявлением разных морфогенетических реакций.

На основе полученных данных, можно заключить, все изученные виды обладают высокой эффективностью регенерации и разной способностью к трансформации.

Можно предположить, что высокая регенерационная способность на фоне способности к трансформации позволила растению сформировать регенеранты из трансгенной ткани. Таким образом, Т-ДНК-подобные последовательности смогли закрепиться и сохраниться в геноме растений после акта трансформации в эволюции.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 08-04-01005-а.

ЭФФЕКТ -ОБЛУЧЕНИЯ КЛУБНЕЛУКОВИЦ И КЛУБНЕПОЧЕК ГЛАДИОЛУСА ГИБРИДНОГО

–  –  –

Пермский государственный университет, Пермь, plyusnina-marina@yandex.ru Под чувствительностью, или резистентностью, понимают реакцию организма на воздействие мутагенами, выражающуюся в изменении обмена веществ, ферментативных процессов, митотической активности, клеточного деления. Небольшие дозы мутагенов как правило стимулируют перечисленные процессы, большие – угнетают и могут привести к летальному исходу. Существует четкая зависимость выхода мутаций и доз воздействия.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

Следовательно, от правильно подобранной дозы мутагенного воздействия во многом зависит успех мутагенной селекции.

Целью нашей работы было выявление эффективных доз -облучения клубнелуковиц и клубнепочек гладиолуса гибридного для использования в мутагенной селекции.

Для выявления критических доз ионизирующей радиации в лаборатории радиобиологии ЕНИ ПГУ на установке источника Cs137 интенсивностью 70 Р/мин проводилось -облучение клубнелуковиц 3-х разборов гладиолуса гибридного: размером более 4 см (240 шт., 1 разбор), 2-4 см (487 шт., 2 разбор), до 2 см (292 шт., 3 разбор) и клубнепочек (760 шт.). Использованные дозы облучения: 8, 12, 16, 18 и 20 кР. После высадки в грунт учитывали всхожесть облученного материала, его выживаемость, аномалии развития и морфологии (морфозы) в течение 3 вегетативных поколений (Мв1, Мв2, Мв3).

Независимо от диаметра клубнелуковиц их всхожесть уменьшается (от 77,6% до 27,6%) по мере возрастания дозы -радиации (от 8 до 20 кР), т.е. всхожесть облученного материала и доза -радиации связаны обратно пропорциональной зависимостью. Кроме того, влияние дозы -радиации на всхожесть клубнелуковиц уменьшается с увеличением размера последних. Наиболее устойчивыми к воздействию -радиацией являются клубнелуковицы диаметром более 4 см, а наименее устойчивыми клубнелуковицы диаметром до 2 см и клубнепочки.

Начиная с года облучения (Мв1) в течение 3 лет вегетации наблюдается тенденция снижения выживаемости растений. По литературным источникам гладиолусы являются устойчивой к -облучению культурой. На второй год вегетации после -облучения (Мв2) выживает от 100% (8 кР) до 21% (16-18 кР) клубнелуковиц 1 разбора, от 68 (8 кР) до 8% (18 кР) клубнелуковиц 2 разбора, от 60 (8 кР) до 13% (20 кР) клубнелуковиц 3 разбора. Некоторые клубнелуковицы (в основном 2 разбора, облученные 8-16 кР) доживают до третьего года и дают вегетативное потомство (Мв3). Клубнепочки менее устойчивы к действию -радиации, до второго года доживает от 9% (12 кР) до 0,9% (18 кР) от общего количества облученных клубнепочек. В третий год после облучения растения в этом случае не развиваются.

Первым свидетельством успешности мутагенного воздействия является проявление различных морфозов. Так, у одного из растений, выращенных из облученных клубнелуковиц (смесь1 разбора, 16 кР), в соцветии было обнаружено развитие двух цветков разной окраски. У растений наблюдались фасциация стебля (смесь1 разбора, 8 кР) и наличие в пределах соцветия различных по окраске пятен на долях околоцветника (смесь1 разбора, 8 кР;

смесь 2 разбора, 16 кР). Дальнейшие наблюдения позволят выяснить, являются ли данные морфологические аномалии наследственным изменением.

Таким образом, эффективными дозами облучения клубнелуковиц можно считать дозы от 8 до 16 кР, а клубнепочек – дозы меньше 8 кР и от 8 до 12 кР.

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА СЛАДКОГО БЕЛКА ТАУМАТИНА II ИЗ THAUMATOCOCCUS

DANIELLII В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ТАБАКА

Пушин А.С.,1,2 Долгов С.В.1,2 Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино, aspushin@rambler.ru;

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, Москва Сверх сладкий белок тауматин II впервые выделен из плодов западноафриканского растения Thaumatococcus daniellii Benth. Сравнение аминокислотной последовательности тауматина, определенной по кДНК, с аминокислотной последовательностью, определенной секвенированием белка, показало, что тауматин синтезируется в виде предшественника (препротауматина), который содержит N-концевой гидрофобный сигнальный пептид, состоящий из 22 а.к. остатков и С-концевой пептид, состоящий из 6 а.к. остатков. Целью наших исследований было изучить влияние удаления N- и С-сигнальных последовательностей препротауматина на характер экспрессии тауматина в трансгенных растениях табака. Для этого были синтезированы несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующие разные формы тауматина: форму с удаленным С-концевым сигнальным пептидом; форму с удаленными N- и С-сигнальными пептидами; форму с удаленным N-концевым сигнальным пептидом. В качестве контроля использовали ген, кодирующий препротауматин - форму, содержащую оба сигнальных пептида. Все нуклеотидные последовательности клонировали в бинарный вектор рВI121 вместо гена uidA, под контроль промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатора гена нопалинсинтазы.

Полученные векторы переносили в супервирулентный обезоруженный агробактериальный штамм СВЕ21, который использовали для трансформации растений табака сорта Petite Havana SR. Отобранные трансгенные линии табака использовали для анализа. Анализ экспрессии гена тауматина при помощи иммуноблотинга с применением поликлональных антител, специфичных к тауматину, показал следующие результаты. При наличии N- и С-сигнальных последовательностей тауматин накапливался внутриклеточно (предположительно в вакуо

<

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

лях) и соответствовал по подвижности зрелому белку, что свидетельствует о прохождении процессинга. Удаление С-концевого гексапептида, привело к секреции тауматина в межклеточное пространство, при этом процессинг проходил корректно. Иммуноферментный анализ показал, что удаление обоих сигнальных пептидов или только N-концевого снизило уровень накопления тауматина в трансгенных растениях табака.

ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ФОРМ МРНК FAS АНТИГЕНА В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ БОЛЬНЫХ РАКОМ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА

Сахарнов Н.А.1, Новиков Д.В1, Алясова А.В. 2, Новикова С.В.1, Уткин О.В.1, Новиков В.В.1 Нижегородский государственный университет, Н. Новгород, colian-molian@mail.ru Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород Особенности злокачественного опухолевого роста зависят от способности клеток экранировать цитотоксическое действие иммунной системы организма. Важным индуктором активации клеточной гибели является Fasантиген. Система Fas/Fas-лиганд имеет множественные пути регуляции, в том числе с участием растворимых форм Fas-антигена. Растворимые формы образуются преимущественно в результате альтернативного сплайсинга мРНК первичного транскрипта. В настоящее время обнаружено около 15 различных вариантов мРНК Fas антигена, встречающихся в клетках в разных сочетаниях. Целью настоящей работы явилась характеристика частоты встречаемости альтернативных форм мРНК Fas антигена в клетках опухолевого очага на разных стадиях рака толстого кишечника.

Материалом для исследования явились 49 образцов клеток опухолевых очагов, полученных из Нижегородского областного онкологического диспансера при резекции опухолей у больных раком толстого кишечника. Из них 35 образцов на 1-2 стадии заболевания и 14 образцов на 3-4 стадии заболевания. мРНК Fas-антигена детектировали методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к местам соединения экзонов пре-мРНК Fas.

В клетках опухолевых очагов больных раком толстого кишечника обнаружено 7 альтернативных форм мРНК Fas антигена. Матричная РНК мембранной формы Fas антигена детектировалась в 100% случаев. Матричная РНК доминирующей растворимой формы Fas антигена с делецией 6 экзона обнаруживалась во всех образцах на 1-2 стадии (35 образцов) и в 86% случаев (12 из 14) на 3-4 стадии заболевания, матричные РНК пяти минорных форм с делециями 3, 4, 5 и 6 экзонов в различных комбинациях встречались с частотой от 22,9% до 91,4% на 1-2 стадии и от 14,3% до 85,7% на 3-4 стадии.

В образцах на 1-2 стадии заболевания мРНК Fas с делецией 5 экзона выявлялась в 31,4% образцов (11 из 35), мРНК Fas с делецией 4 экзона выявлялась в 22,9% случаев (8 из 35) мРНК Fas с делециями 3 и 4 экзонов выявлялись в 91,4% случаев (32 из 35), мРНК Fas с делециями 4 и 6 экзонов выявлялась в 48,6% случаев (17 из 35), а мРНК Fas с делециями 3,4 и 6 экзонов выявлялась в 85,7% случаев (30 из 35).

В образцах на 3-4 стадии заболевания мРНК Fas с делецией 5 экзона выявлялась в 14,3% случаев (2 из 14), мРНК Fas с делецией 4 экзона выявлялась в 35,7% случаев (5 из 14), мРНК Fas с делециями 3 и 4 экзонов выявлялась в 85,7% случаев (12 из 14), мРНК Fas с делециями 4 и 6 экзонов выявлялась в 57,1% случаев (8 из 14), а мРНК Fas с делециями 3,4 и 6 экзонов в 78,6% случаев (11 из 14).

Различия в частотах встречаемости альтернативных форм мРНК между группами не были статистически значимыми. Всего было выявлено 12 различных спектров мРНК на 1-2 стадии и 8 спектров на 3-4 стадии заболевания, отличающихся как по числу, так и составу форм мРНК Fas антигена. Общей особенностью исследованных образцов явилась высокая гетерогенность спектров форм мРНК Fas- антигена.

СОХРАНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ POPULUS TREMULA L. ПОСРЕДСТВОМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

–  –  –

В основе сохранения биологического разнообразия лежит необходимость сохранения генетической компоненты. Среди современных молекулярно-генетических методов широко распространены и перспективны ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)- и IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism)-методы. Основой ISSR

<

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

метода является ПЦР с одним или несколькими праймерами длиной в 15–24 нуклеотида. Такие праймеры амплифицируют фрагменты ДНК, которые находятся между двумя достаточно близко расположенными микросателлитными повторами. IRAP – это анализ полиморфных участков ДНК, амплифицированных между ретротранспозонами. Молекулярно-генетический анализ на основе маркирования этими двумя методами позволяет оценить уровень генетической изменчивости популяции, выявить идентификационные родовые, видовые и популяционные фрагменты, установить генетические расстояния между популяциями. Посредством такого анализа можно определить степень самобытности изучаемых популяций в плане генетического разнообразия, что позволяет судить о их ценности для сохранения биологического разнообразия. В этом направлении уже разработано несколько подходов, одним из которых является молекулярно-генетическая идентификация популяций растений. В рамках этого подхода разработаны и апробированы методики молекулярно-генетической идентификации редких и ресурсных видов растений. Среди древесных видов растений для нужд лесопромышленных комплекса наиболее перспективен Populus tremula L. - тополь дрожащий (осина). Данный вид является одним из самых быстрорастущих и скороспелых, ценных ресурсных видов. В Пермском крае лесами с преобладанием P. tremula покрыты 583.1 тыс. га. На территории Пермского края имеются девять ценных генетических резерватов, содержащих осину. Нами к сегодняшнему дню собран и проанализирован материал особей нескольких популяций, находящихся в городской черте. Для выделения ДНК использовали методику A.M Torres и др.

Для полимеразной цепной реакции использовалась реакционная смесь объемом 25 мкл следующего содержания: 2 единицы Taq-полимеразы («Силекс М»), 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР (Силекс М), 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP, 5 мкл ДНК (концентрация 100 µg/ml). Амплификацию ДНК проводили по программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.;

72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; t° отжига, 5 сек.; 72°С, 5 сек. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Кb DNA Ladder) (“ООО-СибЭнзим-М”), определение длин фрагментов проводилось с использованием программы «Quantity One» в системе гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad, USA). При изученнии популяций выявлено 166 молекулярных маркеров, из которых 71 выявлено ISSR- и 95 – IRAP методами. Общий уровень полиморфизма характеризуется как высокий. Изученный материал систематизирован, написаны протоколы молекулярно-генетического анализа, по которым далее будут проводиться исследования популяций на территории резерватов. В результате сравнительного анализа идентификационных фрагментов особей популяций, находящихся в разных физико-географических условиях и с разной антропогенной нагрузкой будет составлена наиболее полная картина, характеризующая генетическое разнообразие вида, его динамику и особенности, что позволит разработать мероприятия по его сохранению.

ГЕТЕРОТРИМЕРНЫЙ ФАКТОР ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2: СУЩЕСТВОВАНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО САЙТА СВЯЗЫВАНИЯ ГТФ

Столбоушкина Е.А., Архипова В.И., Никонов О.С., Никонов С.В., Гарбер М.Б.

–  –  –

Нами ведутся структурные исследования гетеротримерного фактора инициации трансляции 2 (aIF2) и его функциональных комплексов из гипертермофильной археи Sulfolobus solfataricus (SsoIF2). aIF2 гомологичен эукариотическому фактору eIF2 и выполняет ключевую роль в процессе инициации биосинтеза белка: в ГТФсвязанной форме он доставляет инициаторную тРНК (Met-тРНКi) в P-участок малой рибосомной субчастицы, где происходит образование кодон-антикодонового дуплекса, после чего связанный с фактором ГТФ расщепляется до ГДФ и фактор покидает рибосому. Недавние исследования наших австрийских коллег показали, что субъединица архейного aIF2 имеет неканоническую функцию: защищает мРНК, на 5'-конце которых находится трифосфат, от 53 направленной деградации.

-Субъединица фактора e/aIF2 является рибосомозависимой ГТФазой и по своей структуре относится к семейству белков eEF1А (EF-Tu). e/aIF2 состоит из трех доменов: в первом домене расположен нуклеотидсвязывающий сайт, с которым связываются как ГТФ, так и ГДФ. Проведенная нами экспериментальная работа по исследованию структуры изолированной -субъединицы SsoIF2 в нескольких состояниях (в свободной форме и в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ), привела нас к обнаружению дополнительного ранее неизвестного ГТФ-связывающего сайта на поверхности -субъединицы (между первым и вторым доменами), с которым ГДФ не взаимодействует.

В свете имеющихся в литературе данных о том, что в археях -субъединица aIF2 связывает мРНК, на 5'-конце которых находится трифосфат, мы предположили, что обнаруженный нами дополнительный участок связывания ГТФ на SsoIF2 есть то самое место, с которым взаимодействует 5'-конец мРНК. Чтобы проверить это

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

предположение, была проведена серия экспериментов по взаимодействию aIF2 с мРНК в присутствии различных нуклеотидов. Было показано, что добавление ГТФ или его негидролизуемых аналогов к -субъединице ингибирует ее связывание с мРНК, тогда как ни ГДФ, ни другие нуклеозид-трифосфаты подобного действия не оказывают. Это значит, что ГТФ и мРНК реагируют с идентичным местом на -субъединице, с которым ГДФ не взаимодействует.

В настоящее время наши исследования направлены на выявление причин конкуренции между ГТФ и мРНК за связывание с -субъединицей aIF2 и локализацию участка связывания мРНК на белке. Для этого мы проводим направленный мутагенез предполагаемого участка связывания мРНК, и пытаемся получить пригодные к структурным исследованиям кристаллы комплекса aIF2 с мРНК.

Работа поддержана Российской Академией Наук, РФФИ и Программой МКБ РАН.

ВЫЯВЛЕНИЕ ВИДОВ - ИНДИКАТОРОВ САПРОБНОСТИ ПРЕСНОВОДНЫХ ОЗЁР КАЗАНСКОГО

РЕГИОНА НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

–  –  –

В настоящее время существуют разные системы оценки экологического состояния водоемов с биологической точки зрения, среди которых наиболее часто используется система, предложенная Сладечеком (1973). Она создана для планктонных организмов, обитающих в водоемах Западной Европы, и включает в себя классификацию по индикаторным видам планктонных организмов. И хотя набор видов - индикаторов с индивидуальными индексами сапробности зависит от географического расположения водного объекта, тем не менее, исследователи других регионов также используют эту классификацию, так как определение вида в качестве индикаторного весьма трудоемкий процесс. Таким образом, определение видов- индикаторов фитопланктонных организмов для конкретного региона является актуальной задачей в настоящее время.

Целью нашей работы является выявление видов - индикаторов сапробности пресноводных озёр Казанского региона на основе консервативного гена 18S рРНК.

В работе использованы фрагменты нуклеотидных последовательностей 18S рРНК 92-х индикаторных видов фитопланктона из классификации Сладечека и 53-х фитопланктонных организмов из озер Казанского региона.

Последовательности получены из международной базы данных нуклеотидных последовательностей GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проведено программой CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Построение филогенетического дерева по гену 18S рРНК фитопланктонных организмов выполнено с помощью программы Phylip (http://evolution.gs.washington.edu/phylip).

Анализ филогенетического дерева по гену 18S рРНК для 145-и видов фитопланктонных организмов показал наличие 27 кластеров с высоким уровнем достоверности. Из них, 9 кластеров содержат только индикаторные виды фитопланктона из классификации Сладечека, 3 кластера – только виды фитопланктона из Казанских озер и 15 кластеров содержат и виды фитопланктона из классификации Сладечека и виды фитопланктона из Казанских озер.

По результатам анализа 15 кластеров филогенетического дерева по гену 18S рРНК для всех видов фитопланктона, можно предположить, что виды планктонных организмов из Казанских озер, сгруппированных с индикаторными видами из классификации Сладечека, могут быть использованы в качестве индикаторных видов для нашего региона на основе молекулярно-генетического анализа. Например, виды Closterium gracile Breb. и Closterium acerosum из Казанских озер сгруппировались с индикаторными видами Closterium venus и Closterium ehrenbergii из одного семейства Siphonocladiales (b-сапробность) и могут быть использованы как индикаторы той же сапробности водоема. По результатам предварительного анализа из 53-х видов фитопланктонных организмов Казанских озер 18 могут использоваться в качестве индикаторов сапробности водоемов в Казанском регионе.

Полученные результаты носят предварительный характер и требуют дальнейшей проверки на Казанских водоемах.

Авторы выражают благодарность с.н.с., к.б.н. Палагушкиной О.В. за информацию по видовому составу фитопланктонных организмов Казанских озер.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОХРОМОКСИДАЗНОГО КОМПЛЕКСА В ИЗУЧЕНИИ ФИЛОГЕНИИ

И «БАРКОДИНГА» РЫБ СЕМЕЙСТВА КАРПОВЫХ (CYPRINIDAE).

–  –  –

Молекулярные маркеры могут служить эффективным инструментом при решении фундаментальных проблем, связанных с выяснением эволюционных механизмов возникновения геномной вариабельности. В этом отношении геном карповых рыб, как одной из наиболее молодых, относительно недавно возникших групп костистых рыб, представляет несомненный интерес. Однако до настоящего времени ведутся дискуссии относительно центров происхождения, путей расселения и доместикации дикого предка современного карпа, а также относительно микро- и макроэволюционных процессов, приводящих к возникновению геномного и таксономического разнообразия у представителей всего семейства. В связи с этим, основная цель данного исследования состоит в изучении молекулярной филогении представителей двух подсемейств карповых рыб Cyprininae и Leuciscinae.

Мы впервые реконструировали молекулярно-филогенетические связи между представителями 14 видов из подсемейств Cyprininae и Leuciscinae, обитающих в реках Волжского бассейна. С помощью дендрограмм, построенных на основании полиморфизма каждого из трех генов цитохромоксидазного комплекса - cox1, cox2, cox3, а так же их суммарной последовательности, обнаружено, что выделение изученных видов в отдельные кластеры соответствует принятому в настоящее время разделению на два подсемейства. Для всей изученной группы карповых рыб показано, что уровень изменчивости, по всем трем локусам у представителей подсемейства Ельцовых (Leuciscinae) значительно выше (10.7%), по сравнению с Сазанообразными (Cyprininae) (7.5%), что скорее всего, связано с межвидовой гибридизацией ельцовых.

На основании полиморфизма трех генов показано, что наибольшим полиморфизмом, то есть долей вариабельных сайтов и нуклеотидным разнообразием характеризуется ген сох1 (P=12.26, = 0.123) в отличие от гена сох2 (Р=11.45, =0.115) и гена сох3 (P=11.85, =0.119). Поэтому именно последовательность гена сох1 может оказаться весьма эффективной для идентификации и дифференциации видов карповых рыб. Эти результаты могут использоваться в международной программе «Barcoding of life», основная цель которой состоит в широкомасштабном секвенировании последовательности гена cox1 у организмов различного таксономического ранга.

СТРУКТУРА ГЕНОВ НОВЫХ АНИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ПШЕНИЦЫ TRITICUM KIHARAE

Уткина Л.Л.1, Андреев Я.А.2, Егоров Ц.А.2, Одинцова Т.И.,1, Пухальский В.А.1 Институт общей генетики имени Н.И.Вавилова РАН, Москва, lyuba_utk@mail.ru;

Институт биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва В ходе эволюции у растений выработалась сложная защитная система, которая позволяет им узнавать патогены и активировать защитные реакции, направленные на предотвращение распространения инфекции. Важную роль в этой системе играют антимикробные пептиды (АМП). В последние годы достигнуты значительные успехи в изучении ряда АМП, но структура генов, кодирующих эти соединения, в большинстве случаев остается неизвестной.

Ранее из семян пшеницы T. kiharae были выделены и охарактеризованы два новых пептида Tk-AMP-X1 и TkAMP-X2, которые обладают не описанным ранее цистеиновым мотивом и проявляют высокую ингибирующую активность в отношении ряда фитопатогенных грибов.

Цель работы заключалась в исследовании структуры генов, кодирующих антимикробные пептиды пшеницы Tk-AMP-X1 и Tk-AMP-X2. Для этого из зерен T. kiharae на стадии молочной спелости была выделена тотальная РНК, после чего на матрице мРНК была синтезирована первая цепь кДНК. Затем сочетанием методов 3’- и 5’RACE была получена полноразмерная кДНК целевых генов.

Было показано, что существуют два класса генов, кодирующих цистеин-содержащие пептиды пшеницы, при этом в каждом классе выявлен полиморфизм, обусловленный делециями/вставками и нуклеотидными заменами. Все гены гомологичны между собой и имеют общую схему структурной организации: 5'-нетранслируемую область; область, кодирующую сигнальный пептид; область, кодирующую цистеин-содержащие пептиды (5 пептидов в случае первого класса генов, и 7 – в случае второго), и 3'-нетранслируемую область. При амплификации на матрице ДНК полученные фрагменты не отличались по длине от фрагментов, полученных с кДНК, что свидетельствует об отсутствии интронов в этой части генов.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

На основе последовательностей кДНК были выведены последовательности предшественников обоих пептидов.

Всего было обнаружено 6 последовательностей предшественников, состоящих из сигнального пептида, области, кодирующей 5 или 7 цистеин-содержащих пептидов, разделенных сайтами специфического протеолиза, и Сконцевого домена. В последовательностях предшественников были обнаружены пептиды Tk-AMP-X1 и TkAMP-X2, несколько пептидов, выделенных ранее из экстракта семян T. kiharae, а также ряд ранее неизвестных пептидов.

Таким образом, гены новых АМП пшеницы имеют сложную модульную структуру, обеспечивающую образование сразу нескольких пептидов. Биологический смысл этого явления заключается в том, что активация экспрессии генов сопровождается образованием целого набора АМП, которые, по всей видимости, различаются по спектру антимикробного действия.

СУБЪЕДИНИЦА АЛЬФА7 ПРОТЕАСОМЫ ЧЕЛОВЕКА КАК ВОЗМОЖНЫЙ УЧАСТНИК РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

–  –  –

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, fedorovaolgand@mail.ru Основной функцией протеасом является деградация белков по убиквитин-зависимому механизму. 26Sпротеасома состоит из 20S корового комплекса и двух ассоциированных с ним регуляторных 19S-комплексов.

20S-коровый комплекс образован четырьмя кольцами, каждое из включает в себя семь субъединиц: внешние кольца образованы субъединицами -типа, а внутренние – субъединицами -типа. Три субъединицы -типа обладают каспазо-, трипсино- и химотрипсиноподобной активностью. Субъединицы -типа обеспечивают регуляцию доступа субстрата и присоединение регуляторных комплексов.

Протеасомы составляют около 1% всего клеточного белка и определяют время жизни множества ферментов в клетке, поэтому протеасомы играют ключевую роль в основных клеточных процессах. В 1990x годах было показано наличие у 20S корового комплекса эндорибонуклеазной активности. В дальнейшем было обнаружено, что субъединицы 5 и 1 обладают РНКазной активностью. В исследованиях последних лет продемонстрировано участие некоторых субъединиц 19S комплекса в регуляции транскрипции.

Целью данной работы является определение наличия РНКазной активности у субъединицы 7, экспрессированной в E.coli, и определение спектра белков, способных связываться с этой субъединицей.

Последовательность кДНК субъединицы 7 человека была клонирована в экспрессионный вектор для E.сoli pGEX, и на его основе был получен химерный белок 7, слитый с GST. Были подобраны оптимальные условия синтеза белка 7-GST. В качестве субстрата эндонуклеазной активности была использована меченная [32P] мРНК гена человека p53. Продукты нуклеолиза анализировали с помощью денатурирующего электрофореза высокого разрешения.

Эксперименты показали, что химерный белок 7-GST обладает способностью к эндорибонуклеолизу. Выяснено, что активность зависит от наличия в реакционной среде ионов Ca2+ и Mg2+. Важно отметить, что белок был экспрессирован в E.coli, т.е. не нес посттрансляционных модификаций, и при этом проявил РНКазную активность.

Для определения спектра белков, способных связываться с субъединицей 7 из культуры К562 был получен клеточный экстракт, который разделяли на ядерные и цитоплазматические фракции, а затем инкубировали с белком 7. Связавшиеся с 7 белки разделяли с помощью двумерного электрофореза. Для идентификации белков использовался метод масс-спектрометрии.

В результате проведенной работы был получен спектр белков, способных связываться с субъединицей альфа 7.

Все белки можно разделить на несколько групп, отвечающих за такие важные процессы в жизнедеятельности клетки как транскрипция (фактор ассоциированный с РНК полимеразой II, фактор инициации транскрипции II и др.), трансляция (фактор элонгации 1, лизил-тРНК-синтетаза и др.), сплайсинг (фактор сплайсинга 3A, гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин и др.) и репарация (АТФ-зависимая РНК-геликаза и др.). На основе полученных результатов и учитывая РНКазную активность 20S корового комплекса, можно рассматривать протеасому как важный элемент системы регуляции экспрессии генов на различных этапах.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (проект №08-04-00834 и 10-04-01234 ) и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

–  –  –

Казанский государственный университет, Казань, shade0602@yandex.ru ДНК штрих-кодирование – современный таксономический метод, в котором используются короткие генетические маркеры в ДНК организмов, чтобы определить их принадлежность к конкретному виду. У эукариот за штрих код принимают короткий митохондриальный ген mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene.

В настоящее время в базе данных GenBank на сайте NCBI представлено всего лишь 12 тыс. фрагментов mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) genes по сравнению с общим количеством представленных нуклеотидных последовательностей. В то же время в базе данных по СО1 отсутствует информация по зоопланктонным организмам Казанского региона.

Целью нашей работы является идентификация зоопланктонных организмов пресноводных водоемов г.Казани (Россия) по гену mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) genes В работе использованы зоопланктонные организмы из пресноводных озер Кабан, которые выловлены и определены в соответствии с существующими методиками. Для выделения гена mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) genes использованы универсальные праймеры для эукариот: LCO1490: 5'ggtcaacaaatcataaagatattgg-3', HC02198: 5'-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3'. Условия проведения эксперимента описаны в статье Folmer et al.

Была поставлена серия экспериментов, в результате которой получены 5 последовательностей: для организма Brachionus calyciflorus получена последовательность длиной 661 bp, Keratella cochlearis - 705 bp, Scapholebecis mucronata - 658 bp, Chydorus sphaeriaus - 658 bp, Mesocyclops leacrarta - 658 bp. Эти последовательности проанализированы методами биоинформатики и подготовлены к вводу в базу данных на сайте NCBI с использованием программы Barcode Submission Tool.

Полученные положительные результаты позволяют нам продолжить работы по секвенированию гена CO1 зоопланктонных организмов в масштабах Казанских озер и стать активными участниками международного проекта Barcode of Life projects.

РАЗРАБОТКА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

–  –  –

Во многих лабораториях мира созданы и исследуются трансгенные растения - продуценты вакцин против различных возбудителей болезней человека, в том числе и против гепатита В, однако коммерческие вакцинные препараты на основе трансгенных растений до сих пор не созданы. Нами получены трансгенные растения картофеля содержащие ген поверхностного антигена вируса гепатита В HBsAg под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35SS. Начато проведение доклинических испытаний иммуногенности клубней картофеля на лабораторных мышах. В экспериментах использовали три группы по 10 аутбредных мышей NMRI весом 23-25 г. Животные первой и второй групп питались трансгенными клубнями картофеля (по 20 г, что составило 20 мкг HBsAg) на 1, 7 и 14-е сутки эксперимента, причем мышам первой группы давали в качестве адъюванта по 20 мкг гликопина (ГМДП). Перед экспериментом мышей выдерживали 12 ч без кормления.

Контрольная группа получала только стандартный корм без картофеля. Для оценки иммунитета против гепатита В у мышей каждой группы собирали препараты крови из хвостовой вены на 6, 12, 22, 36, 50, 78, 86, 100, 114, 120-е сутки эксперимента. Показано, что уровень антител к HBsAg в сыворотке крови мышей первой и второй групп начинал увеличиваться на 36-50-е сутки после первого кормления. У семи мышей группы, получавшей трансгенный картофель вместе с адъювантом ГМДП, содержание антител к HBsAg составило 4-84 мМе/мл. У четырех мышей, получавших картофель без адъюванта, уровень антител на 50-е сутки с начала эксперимента был выше – до 9-169 мМе/мл. В крови мышей третьей, контрольной группы антител к HBsAg не обнаружено. С целью исследования усиления иммунного ответа против HBsAg, синтезируемого трансгенными растениями, на 71-е сутки эксперимента животным первой и второй групп внутрибрюшинно вводили коммерческую рекомбинантную дрожжевую вакцину против гепатита В (0.5 мкг/мышь). Содержание антител стало повышаться у мышей обеих групп уже через неделю и достигло максимума у разных мышей через 15-43 суток после инъекции.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

В сыворотке крови мышей обеих групп количество антител к HBsAg повысилось до 112-350 мМе/мл. Достоверных различий в уровне антител между группами мышей, получавших трансгенный картофель с адъювантом (ГМДП) и без адъюванта, не обнаружено. Однако в первой группе большее количество мышей дало иммунный ответ (7 из 10) по сравнению со второй группой (4 из 10). На 120-е сутки после начала эксперимента уровень антител к HBsAg в обеих группах мышей оставался протективным (более 10 мМе/мл). Подбор оптимальной концентрации ГМДП для усиления иммунного ответа может явиться целью дальнейших исследований. Для повышения биологической безопасности вакцины получены безмаркерные растения табака и томата, содержащие ген поверхностного антигена вируса гепатита В HBsAg под контролем промотора CaMV 35SS. Эти растения не содержат маркерных и селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Трансгенные растения синтезировали HBs-антиген на уровне 0.01-0.05% от общего растворимого белка, что достаточно для проведения доклинических испытаний на лабораторных животных. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 08-08-00328 и является победителем Программы Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере "Участник молодежного научно-инновационного конкурса (У.М.Н.И.К)"-2009.

–  –  –

Нами выделена линия мутантов по гену HSM3, несущих точечную мутацию и полную делецию. Ген HSM3 картирован нами на правом плече II хромосомы на расстоянии 25сМ от гена HIS7, и контролирует минорный путь системы коррекции ошибочно спаренных оснований (КОСО), имеет 80% гомологию с геном MSH2 основной системы КОСО. Все мутанты по гену HSM3 дефектны по коррекции искусственных гетеродуплексов ДНК. Мутации также приводят к увеличению частот спонтанного мутагенеза канаванин-устойчивости, а также повышают чувствительность к широкому спектру мутагенов (УФ, -лучи, цисплатина и др.). Нами выявлено, что мутантные штаммы могут быть использованы как тестеры: при обработке мутагенами замечено, что изменяются частоты митотического кроссинговера и сегрегации. Дополнительно, нами впервые на клетках дрожжей показан мутагенный и рекомбиногенный эффект цисплатины.

Проведено исследование более 80 взаимодействий гена HSM3 с генами различных репарационных групп. Установлено, что ген HSM3 также принимает участие в рекомбинационной репарации: работает на RAD59независимом пути, взаимодействуя с генами XRS2, RAD52, RAD51 и RAD54. Анализ двойных мутантов hsm3rad54 показал их сверхвысокую чувствительность к летальному действию мутагенов, а анализ двойных мутантов hsm3rad52 выявил их склонность к накоплению летальных повреждений и падение частот спонтанного репаративного мутагенеза при неизменных во времени частотах спонтанного репликативного мутагенеза.

Также было установлено, что основным геном в группе рекомбинационной репарации является ген XRS2, а не RAD52, как считалось ранее.

Опыты по сверхэкспрессии белка Hsm3 на среде с раффинозой и галактозой и обработка мутантов hsm3 цисплатиной на фоне мутации rad2 позволили предположить мультидоменную структуру продукта гена HSM3. Это нашло подтверждение в последних полученных данных, связанных с процессами модификации и ремодуляции хроматина. Исследование взаимодействия белков Hsm3 и Hat1 (ген HAT1 кодирует гистон-ацетилтрансферазу

1) показало, что продукт гена HSM3 принимает участие в процессах модификайии и ремодуляции хроматина в качестве вспомогательного опознающего белка, что имеет отражение, как в процессах транскрипции, так и в процессах репарации ДНК: привнесение отрицательных зарядов с помощью Hat1 приводит к «расталкиванию»

гистонов и ДНК становится открытой. Белок Hsm3 в данном случае обеспечивает дополнительное связывание (аналогично белкам SSB или PCNA) и привлечение других участников репарационного или транскрипционного процесса. Нами установлено что С-конец гена HSM3 отвечает за спонтанный мутагенез, N-конец отвечает, предположительно, за связь с ДНК и процесс поиска и опознавания повреждения, а центральная область кодирует домены, отвечающие за взаимодействие с различными белками как в репарационных и репликативных комплексах, так и на уровне хроматиновых (нуклеосомных) структур.

Для гена HSM6 (и, соответственно, белка Hsm6) были проведены сходные эксперименты. Нами показано, что он работает в комплексе с Hsm3, как каталитическая субъединица, при этом является аллелем гена PSY4, кодирующем субъединицу ядерной фосфатазы 4, и участвует в процессах модификации и ремодуляции хроматина, но в отличие от Hsm3 не в системе КОСО, а в системы нуклеотид-эксцизионной репарации у дрожжей.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ВАКУОЛЯРНЫХ АНТИПОРТЕРОВ В ТРАНСГЕННЫХ

РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ

–  –  –

Засоление является одним из основных абиотических стрессов при возделывании культурных растений. Более 800 млн. гектар в мире подвержены засолению, что составляет примерно 6% от площади всех земель. Высокий уровень ионов натрия (Na+) пагубно действует на функции растительных клеток (на калиевое питание, активность клеточных ферментов, фотосинтез и другие аспекты метаболизма). Сейчас большое внимание уделяется выявлению генов, отвечающих за устойчивость растительных клеток к солевому стрессу. В качестве примера можно указать гены SOS систем, наиболее важными из которых считаются гены Na+/H+ вакуолярных антипортеров. Впервые вакуолярный Na+/H+ антипортер был выделен из Saccharomyces cerevisiae. Позднее ген Na+/H+ вакуолярного антипортера AtNHX1 обнаружен у растений Arabidopsis. Сверхэкспрессия AtNHX1 в трансгенных растениях Arabidopsis привела к повышению устойчивости к высоким концентрациям соли. Вакуолярные Na+/H+ антипортеры выводят избытки ионов Na+ из цитоплазмы клеток в вакуоли, таким образом, поддерживая постоянный ионный состав в цитоплазме и гомеостаз растительной клетки.

Пшеница (Triticum aestium L.) – основная и самая важная продовольственная культура в большинстве стран мира. Для увеличения устойчивости растений к высоким концентрациям Na+ в почве, нами изучена экспрессия генов вакуолярных антипортеров в трансгенных растениях пшеницы. Трансгенные растения получали путем баллистической трансформации пшеницы сорта «Андрос» несколькими векторными конструкциями. В первом случае проводилась ко-трансформация двумя векторами: вектор psGFPBAR содержал репортерный ген gfp и ген ацетилфосфотрансферазы bar, придающий устойчивость клеткам растений к гербицидам на основе фосфинотрицина; вектор pUCAgNHX#4 содержал ген вакуолярного антипортера agnhx галофита Atriplex gmelini, под контролем конститутивного промотера Ubi кукурузы. Во втором случае, проводилась трансформация векторной конструкцией psUHV, содержащей ген вакуолярного антипортера ячменя hvnhx, находящийся под действием промотера Ubi кукурузы, а так же репортерный ген gfp и ген ацетилфосфотрансферазы bar.

В результате генетической трансформации векторами pUCAgNHX#4 и psGFPBAR нами было получено 66 первичных линий. В результате трансформации вектором psUHV было получено 13 первичных линий. Вставку гена антипортера проверяли методом ПЦР-анализа, который показал наличие фрагмента гена agnhx в 46-ти линиях и фрагмента гена hvnhx во всех изначально полученных 13-ти линиях.

Далее проводили отбор гомозиготных потомков первичных трансгенных растений пшеницы со вставкой генов антипортеров, с целью дальнейшего исследования экспрессии этих генов и осуществления тепличных испытаний на солеустойчивость. Анализ экспрессии генов проводили методом ОТ-ПЦР, который подтвердил наличие фрагментов мРНК гена антипортера agnhx в 26 линиях, и фрагментов мРНК гена антипортера hvnhx в 8 линиях, в то время как в отрицательном контроле экспрессия обнаружена не была.

Дальнейшие исследования направлены на анализ устойчивости гомозиготных трансгенных семей пшеницы в условиях зимних теплиц для выявления перспективных форм устойчивых к солевому стрессу.

ОСОБЕННОСТИ ЗАВЯЗЫВАНИЯ СЕМЯН САДОВЫХ ЛИЛИЙ ПРИ РАЗНЫХ ВАРИАНТАХ

ОПЫЛЕНИЯ

–  –  –

Пермский государственный университет, Пермь, chert-nikita@yandex.ru Гибридизация – наиболее эффективный и широко применяемый способ создания популяций исходного селекционного материала. Начальным этапом селекции лилий является изучение биологии цветения, особенностей семенного размножения и экологии опыления.

Целью работы являлось изучение особенностей семенного размножения при различных вариантах опыления садовых лилий в условиях Предуралья для оптимизации селекционного процесса.

Для определения типа опыления лилий из разных сортовых групп было поставлено 6 вариантов опыта:

1) изоляция соцветий без дальнейшего вмешательства в процесс опыления; 2) изоляция соцветий с последующим искусственным самоопылением; 3) изоляция соцветий с кастрированными цветками с последующим искусственным перекрестным опылением; 4) изоляция соцветий с кастрированными цветками без дальнейшего

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

вмешательства; 5) кастрация без изоляции и вмешательства, для установления необходимости изоляции при перекрестном опылении; 6) свободное опыление.

В опытах было привлечено 32 сорта лилий (956 цветков), относящихся к трем сортогруппам: Азиатские гибриды (АГ), LA-гибриды (LA) и Мартагон гибриды (МГ). Отбор родительских пар проводили визуально по комплексу декоративных и хозяйственно важных признаков.

При изоляции цветков с дальнейшим искусственным самоопылением семена завязались только у АГ (11,3%), что свидетельствует о возможности у них самоопыления, а также о присутствии системы самонесовместимости у остальных сортогрупп. Отсутствие положительных результатов при изоляции соцветий без дальнейшего вмешательства в процесс опыления свидетельствует об отсутствии особого механизма реализации автогамии.

При скрещивании лилий в пределах одной садовой группы и имеющих сходное происхождение, способны завязывать семена только АГ (2,4% случаев, доля выполненных семян 2,0%). Также семена завязывались, если в качестве материнских использовали АГ (13,8% случаев, доля выполненных семян 11,3%). Также результативным оказалось скрещивание АГ ‘Латгалия’ х L. henryi Baker (в 84,6% случаев, доля выполненных семян 3,4%).

Сорт ‘Латгалия’ является гибридом, для получения которого в качестве одной из родительских форм использовалась L. henryi. При скрещивании МГ ‘Лилит’ и L. tsingtauense Gilg. семена завязались в 35,3% случаев (доля выполненных семян 0,3%). L. tsingtauense относится к секции Martagon. Виды из этой же секции использовались для выведения сорта ‘Лилит’. Таким образом, завязываемость семян зависит от степени родства скрещиваемых лилий. При использовании LA в качестве материнских и отцовских форм семена не завязываются, что вероятно, связано со сложным гибридным происхождением данной сортогруппы и высокой степенью стерильности пыльцы (70,4%).

При свободном опылении семена завязались только у АГ (7,8% цветков) и у LA (4,2% цветков). Самая высокая семенная продуктивность при свободном цветении и при скрещиваниях в сравнении с другими сортогруппами наблюдается у АГ, что свидетельствует о высокой репродуктивной способности и перспективности их использования в селекционных целях при гибридизации.

В опытах с изоляцией соцветий с кастрированными цветками без дальнейшего вмешательства семена не завязываются. Апомиктичное завязывание семян у изученных лилий, скорее всего не возможно. Кроме того, выяснено, что изоляция кастрированных цветков при постановке скрещиваний не обязательна.

–  –  –

Неселективный антигистаминный препарат димебон применялся в России в течение длительного времени, пока не были предложены более эффективные антигистаминные средства. Позже на основании известных свойств препарата было сделано предположение, что димебон может останавливать или замедлять прогрессию нейрологических заболеваний, характеризующихся постепенным снижением когнитивной функции. Эта гипотеза была подтверждена в ряде исследований на клеточных культурах и на животных – моделях нейродегенеративных заболеваний, а также в некоторых клинических испытаниях (пациенты с болезнью Альцгеймера, хореей Гентингтона). Был сделан вывод, что димебон может рассматриваться в качестве кандидата на роль болезньмодифицирующего препарата для лечения протеинопатий (заболеваний, в патогенезе которых принимает участие агрегация и отложение определенных белков), сопровождаемых нейродегенерацией. Одна из наиболее распространенных протеинопатий, характеризуемых агрегацией белка альфа-синуклеина, – болезнь Паркинсона (БП). Однако на настоящий момент данных по эффектам димебона при этом заболевании нет.

В задачи исследования входило изучение способности димебона ослаблять вызванные агрегацией альфасинуклеина патологические процессы, имеющие место на ранних стадиях БП. Была использована модель ранней стадии БП – трансгенные мыши со сверхэкспрессией укороченной (содержащей аминокислотные остатки 1-120) формы человеческого альфа-синуклеина под контролем промотора гена тирозингидроксилазы крысы.

Ранее в экспериментах in vitro было показано, что укороченная форма альфа-синуклеина по сравнению с белком нормальной длины характеризуется способностью к более быстрой агрегации. Кроме того, известно, что развитию двигательной патологии и значительным изменениям в нейронах области черной субстанции у пациентов с БП предшествует развитие патологических изменений в обонятельной луковице (ранняя стадия заболевания).

Было сформировано две группы животных – контрольная (n=9) и экспериментальная (n=10), последняя получала димебон с питьевой водой (10 мг/мл) с возраста 3 мес до 14 мес.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА

В ряде поведенческих тестов, позволяющих оценить двигательную активность, баланс и координацию животных (домашняя клетка, камера активности, ротарод, горизонтальная перекладина, перевернутая сетка), статистически значимых различий между контрольной и экспериментальной группами обнаружено не было. Гистологические (определение числа дофаминергических нейронов в черной субстанции и вентральной области покрышки), молекулярно-биологические (определение уровня экспрессии альфа-синуклеина в обонятельной луковице при помощи RT-ПЦР и вестерн-блоттинга) и биохимические (определение уровня дофамина и его метаболитов в полосатом теле при помощи ВЭЖХ) исследования головного мозга животных обеих групп также не выявили статистически значимых различий.

Нами был сделан вывод, что димебон не оказывает влияния на фенотип животных, у которых была смоделирована ранняя стадия БП.

ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИНГАЛЯЦИОННОГО КОМПЛЕКСА «ПРОПОЛИС – МАТОЧНОЕ

МОЛОЧКО» НА КРИСТАЛЛОГЕНЕЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРЫС ПРИ ОТЕКЕ ЛЕГКИХ

–  –  –

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского, Н.Новгород, aaanashkina@yandex.ru Известно, происходит частичное разрушение альвеол и прилегающих капилляров, в результате чего образуется множество эндогенных токсинов, попадающих в кровь и создающих интоксикацию, что является важным компонентов патогенеза ОЛ. В связи с этим, актуальным является поиск адекватных средств и методов детоксикации. Естественной технологией детоксикации является применение продуктов пчеловодства, в том числе прополиса и маточного молочка, однако особенности этого эффекта при изучаемом патологическом состоянии изучены недостаточно. Любое изменение физико-химического состояния внутренней среды организма, в том числе плазмы и сыворотки крови, находит свое отражение в особенностях структуризации биосреды при дегидратации. Это обусловливает выбор в качестве метода исследования биокристаллоскопии. Поэтому целью работы служило исследование влияния ингаляционного комплекса «прополис – маточное молочко» (патент РФ №21740002 от 15.09.2000) на собственный и инициированный кристаллогенез сыворотки крови крыс при моделировании ОЛ.

Для оценки физико-химических свойств сыворотки крови мы использовали методы оценки кристаллогенных (классическая кристаллоскопия) и инициирующих (сравнительная тезиграфия) свойств сыворотки крови 15 крыс, не подвергавшихся воздействиям (интактных), с модельным ОЛ без лечения (контрольных), а также получавших лечение ОЛ ингаляционным комплексом «прополис – маточное молочко» (опытных). ОЛ воспроизводили путем внутрибрюшинного введения адреналина в дозе 0,5 мг/к Описание результатов выполняли с использованием специальной системы критериев. В качестве базисного вещества при выполнении тезиграфического исследования применяли 0,9% раствор хлорида натрия. Фиксацию изображений фаций производили с помощью морфометрического комплекса Leica.

На основании анализа кристаллограмм сыворотки крови крыс контрольной группы установлено, что при моделировании ОЛ наблюдается умеренное усиление структуризации образцов, отмечаемое вследствие незначительного нарастания их индекса структурности и кристаллизуемости. Наличие у животных контрольной группы высокого уровня степени деструкции фации связано с моделированием у них ОЛ. Выраженное снижение четкости краевой зоны образцов указывает на уменьшение уровня протеинемии, связанное с деградацией белковых молекул эндогенными токсинами. В опытной группе наблюдается значимое нарастаниие структуризации образцов, что проявляется в увеличении их индекса структурности и кристаллизуемости, а так же снижение степени деструкции, по сравнению с контролем. Тезиграфический индекс у животных контрольной группы существенно ниже, чем в интактной. Аналогичная, но менее значимая тенденция была зарегистрирована в отношении кристалличности. Это свидетельствует об изменении химического состояния исследуемого биоматериала из-за гипоксии и появления эндогенных токсинов. У опытной группы уровень тезиграфического индекса и степени деструкции приближаются к уровню фаций крыс интактной группы.

В целом, моделирование ОЛ у крыс приводит к существенным преобразованиям физико-химических свойств сыворотки крови, частично купируемым путем применения ингаляционного комплекса «прополис – маточное молочко», что при отеке легких (ОЛ) возникает гипоксия.

СРАВНЕНИЕ СПОСОБНОСТИ К АДАПТАЦИИ К ГЕЛИОГЕОФИЗИЧЕСКИМ ВОЗМУЩЕНИЯМ У

ТАБАКОЗАВИСИМЫХ МУЖЧИН И ЖЕНЩИН

Бабаева М.И. 1, Рогачева С.М. 1, Самсонов С.Н. 2, Вишневский В.В. 3 Саратовский государственный технический университет, Саратов, Россия, risavalasava@yandex.ru Институт космофизических исследований и аэрономии СО РАН им. Ю. Шафера, Якутск Институт проблем математических машин и систем НАН Украины, Киев, Украина Известно, что мужчины более подвержены влиянию магнитных бурь, чем женщины. Кроме того уровень адаптации человека к воздействию гелиогеофизических возмущений зависит от географической широты и климатических условий его проживания. Различные антропогенные факторы, в частности пристрастие к табакокурению, могут ослабить адаптационные способности человека.

ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

В связи с этим представляет интерес сравнить влияние магнитных бурь на сердечно-сосудистую систему табакозависимых мужчин и женщин, проживающих в экстремальных условиях Севера.

Исследования проводятся в рамках участия в международном научно-исследовательском проекте «Гелиомед» в нескольких городах России и Украины. В работе используется оригинальный датчик ЭКГ первого отведения «Фазаграф». Обработка результатов измерений проводится централизованно в режиме on-line в Институте проблем математических машин и систем НАН Украины (Киев).

Нами были проанализированы данные, полученные по экспериментальной группе Якутска, за период со 2 по 24 ноября 2009.

В обследовании участвовали курящие мужчины и женщины различного возраста и физического здоровья. Ежедневно все обследуемые проходили четырехкратную регистрацию параметров ЭКГ первого отведения. Измерения проводились в состоянии покоя, после стресс - теста, после физической нагрузки и минутного отдыха.

Состояние сердечно-сосудистой системы человека оценивали по коэффициенту симметрии Т-зубца на ЭК Рассчитывали изменение коэффициента симметрии Т-зубца у каждого обследуемого после стресс-теста и физической нагрузки относительно состояния покоя.

Уровень магнитной возмущенности определялся по значению Кр индекса, который предназначен для описания вариаций магнитного поля Земли. За период измерений были зафиксированы 4 дня со значением Кр от 8 до 13 ед., что свидетельствует о значительном возмущении магнитного поля Земли.

Анализ данных показывает, что, как правило, за день до всплеска магнитной возмущенности у курящих мужчин наблюдается увеличение коэффициента симметрии Т-зубца после физической нагрузки в среднем в 4 раза относительно состояния покоя. Значение коэффициента сохраняется в течение 2-3 дней. У курящих женщин резких изменений данного параметра в зависимости от уровня магнитной возмущенности не наблюдается, как после физической нагрузки, так и после стресс-теста. Это свидетельствует о том, что в экстремальных условиях Севера сердечно-сосудистая система женщин более устойчива к воздействию гелиогеофизических возмущений и антропогенных факторов, в частности отрицательному воздействию продуктов горения табака. То есть женский организм обладает более высоким уровнем адаптации к постоянно меняющимся условиям окружающей среды.

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ В НОРМЕ И ПРИ КУРЕНИИ

–  –  –

Нижегородская государственная медицинская академия, Н.Новгород, vpfrantsuzova@rambler.ru Образование активных форм кислорода (АФК) и свободнорадикальное окисление (СРО) являются естественными процессами, постоянно протекающими в организме. Высокий уровень свободнорадикальных процессов в живой клетке может выступать как повреждающий фактор, нарушающий функционирование внутриклеточных структур и вызывающий развитие патологических процессов. Изучение процессов с участием свободных радикалов при негативном действии внешних факторов среды, курении, алкоголизме и наркомании в последнее время все больше привлекает внимание многих исследователей.

Целью работы явилось изучение интенсивности свободнорадикального окисления в ротовой жидкости в норме и при курении. Исследование проводилось на базе кафедры биохимии им. Я. Городисской НижГМА. Обследовано 100 человек, среди которых 50 человек составили контрольную группу (некурящие) и 50 – опытную группу (курящие). Оценку состояния процессов СРО в ротовой жидкости проводили методом индуцированной хемилюминесценции. Определяли параметр S (характеризует интенсивность СРО) и коэффициент tg2 (показатель антиоксидантной активности, АОА). Величину рH ротовой жидкости измеряли с помощью иономера pX-150 (потенциометрический метод).

Выявленные различия в интенсивности СРО у мужчин и женщин в контрольной группе были статистически не значимы, при этом антиоксидантная активность была несколько выше у женщин в сравнении с мужчинами. В группе курящих установлено увеличение параметра S у мужчин в 2,3 раза, у женщин - в 1,7 раза по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует об активации процессов СРО в ротовой полости при курении. В то же время отмечено снижение коэффициента tg2, характеризующего АОА ротовой жидкости, на 43 % - у курящих мужчин и на 22 % - у курящих женщин в сравнении с исходным уровнем. Активация процессов СРО в ротовой жидкости при курении может быть обусловлена сдвигом кислотно-основного равновесия в полости рта.

Действительно, было выявлено закисление ротовой жидкости у курящих людей не зависимо от пола (рН=5,8±0,06) по сравнению с контрольной группой (рН=6,8±0,16). Уменьшение рН в ротовой полости может приводить к снижению активности ферментов антиоксидантной защиты слюны. Табачный дым является мощным источником оксидантов, газовая фаза дыма содержит высокие концентрации реактивных диенов и оксида азота. Пероксинитрит, образующийся при взаимодействии оксида азота с супероксидом, способен изменять работу ферментов слюны. Уменьшение АОА в ротовой жидкости может быть также обусловлено

ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

ингибирующим влиянием компонентов табачного дыма на пероксидазу, уровень витаминов С, А и глутатиона в слюне.

Таким образом, для всех курящих людей выявлено уменьшение активности антиоксидантной системы и увеличение интенсивности СРО в ротовой жидкости. Отмеченные изменения были значительнее выражены у курящих мужчин в сравнении с курящими женщинами. Высокий уровень свободнорадикальных процессов в слюне курильщика может приводить к нарушению функционирования компонентов ротовой жидкости, сдвигам в регуляции зубочелюстной системы и развитию различных заболеваний.

ВЛИЯНИЕ ЭТАНОЛА НА ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ В МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ И ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ФРАКЦИЯХ КЛЕТОК

ПЕЧЕНИ

–  –  –

Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского, Н. Новгород, kfg@bio.unn.ru Этиловый спирт широко распространен в живой природе. Малая диссоциация и очень слабая полимеризация небольших молекул этанола (радиус 0,431 нм) обусловливают его необычайную способность растворяться в воде и жирах и, следовательно, легко проходить через биологические мембраны. Данные свойства обусловливают его важную роль в физиологических и биохимических процессах, происходящих в организме... Окисление этанола в организме человека и животных протекает в две стадии. Первая осуществляется с помощью алкогольдегидрогеназы, микросомальной этанол - окисляющей системы (МЭОС) и каталазы. Образующийся из этанола ацетальдегид подвергается метаболизму во второй стадии, где при участии альдегиддегидрогеназы из него нарабатывается ацетат. Основной путь метаболизма этанола в целом организме – окисление его с помощью алкогольдегидрогеназы; каталазный и микросомальный пути являются минорными, приобретающими значение лишь в условиях угнетения основного, например, при развивающемся дефиците никотинамидадениндинуклеотида (НАД) в условиях хронической алкоголизации.

В наших экспериментах внутрибрюшинное введение крысам этанола в дозе 4,5 г/кг вызывало сон, средняя продолжительность которого составила 94,0±8,8 мин, что согласуется с данными ряда авторов. Окисление этанола осуществляется преимущественно в печени, где метаболизируется до 95% введенного в организм алкоголя, что приводит к изменениям в ферментных системах этого органа. Исследование активности лактатдегидрогеназы в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток печени крыс после этанолового сна показало, что после внутрибрюшинного введения животным этанола в дозе 4,5 г/кг у них наблюдалось в основном повышение активности данного фермента. В митохондриальной фракции активность лактатдегидрогеназы в прямой реакции составила 720,7±44,3 нмоль/мин на мг белка, что достоверно (р0,001) выше по сравнению с контролем в 1,7 раза, в обратной – 1135,0±80,6 нмоль/мин на мг белка, что также достоверно (р0,001) выше данных контрольной группы в 2,2 раза. В цитоплазматической фракции клеток печени активность фермента в прямой реакции составила 1330,0±51,2 нмоль/мин на мг белка, что достоверно (р0,001) выше по сравнению с контролем в 1,9 раза; в обратной реакции активность лактатдегидрогеназы уменьшилась и составила 800,9±58,2 нмоль/мин на мг белка, что достоверно (р0,05) ниже данных контрольной группы в 1,2 раза. Исследование активности алкогольдегидрогеназы в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток печени крыс показало, что после внутрибрюшинного введения животным этанола в дозе 4,5 г/кг у них наблюдалось в основном повышение активности данного фермента. В митохондриальной фракции активность алкогольдегидрогеназы в прямой реакции составила 114,1±8,6 нмоль/мин на мг белка, что достоверно (р0,001) выше по сравнению с контролем в 1,8 раза, в обратной – 181,8±17,6 нмоль/мин на мг белка, что также достоверно (р0,001) выше данных контрольной группы в 1,9 раза. В цитоплазматической фракции клеток печени активность фермента в прямой реакции составила 183,1±22,1 нмоль/мин·мг белка, что достоверно (р0,05) выше по сравнению с контролем в 1,3 раза. Достоверных отличий по алкогольдегидрогеназной активности в обратной реакции в цитоплазматической фракции между группой этанола и контролем обнаружено не было.

ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ НА МЕТАБОЛИЗМ НЕЙТРАЛЬНЫХ ЛИПИДОВ В ТИМОЦИТАХ КРЫС

–  –  –

ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

В механизмах адаптации и устойчивости определенная роль отводится липидам, принимающих участие как в структурно-функциональной организации клеточных мембран, так и в индукции метаболического ответа – в качестве мессенджеров трансмембранных сигналов. Целью нашей работы было исследование изменений метаболизма нейтральных липидов в клетках тимуса крыс, находящихся в состоянии искусственного гипобиоза. Искусственная гипотермия у крыс вызывалась понижением температуры тела в условиях гипоксии/гиперкапнии методом закрытого сосуда (tсреды=1-2 С). При снижении температуры тела до 15-17 С животные впадали в состояние холодового наркоза с угнетением подвижности, частоты дыхания, сердцебиения и электрической активности головного мозга. В качестве объекта исследования использовали тимус крыс. Животных декапитировали в состоянии гипотермии (tтела=15-17 С), через 24 часа после окончания воздействия гипоксии/гиперкапнии/гипотермии (tтела=37 С) и в состоянии нормотермии (контроль). Выделяли тимоциты, инкубировали их в растворе Кребс-Рингера (pH=7.4) в присутствии 2-[14C]-ацетата при 37 С в течение 15 и 30 минут.

После отмывки от радиоактивной метки определяли динамику ее включения в холестерин, свободные жирные кислоты, моно- и диглицериды, а также количество липидов. Было показано достоверное увеличение количества свободных жирных кислот, снижение количества моно- и диглицеридов у крыс, находящихся в состоянии холодового наркоза. Более того, снижение количества диглицеридов сохранялось у крыс и через 24 часа после выхода из этого состояния. Показано, что в состоянии искусственной гипотермии происходит увеличение скорости синтеза моноглицеридов, а через 24 часа после возвращения животного в состояние нормотермии отмечается увеличение скорости синтеза холестерина по сравнению с контрольными значениями.

Работа поддержана грантом РФФИ №09-04-00993-а.

ФАКТОРЫ КИСЛОРОДНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ОРГАНИЗМА СПОРТСМЕНОВ РАЗНОГО ВОЗРАСТА

И ЗАНИМАЮЩИХСЯ РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ СПОРТА

–  –  –



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |
Похожие работы:

«УТВЕРЖДЕНА распоряжением Правительства Российской Федерации от 28 августа 2003 г. № 1234-р Энергетическая стратегия России на период до 2020 года \\601807 Содержание I. Цели и приоритеты Энергетической стр...»

«33. ИВАН-МОЖЖЕВЕЛЬНИК Из моего школьного дневника: 31 июля 1963 года. Падают листья с берез, чернеют вспаханные поля, зреют яблоки в садах. Осень близко, последний год учебы, а там. Мне надоело читать книги, читаю без интереса, абы только провести время. Это я усл...»

«ПРОТОКОЛ общественных обсуждений в форме общественных слушаний материалов проектной документации АО "Апатит" "Восточный рудник. Карьер Центральный. Отработка запасов апатит-нефелиновых руд участка Ийолитовый отрог", включая материалы по оценке воздействия на окружающую среду (ОВО...»

«Jacques Derrida la voix et le phnomne: introduction au problme du signe dans la phnomnologie de Husserl Жак ДЕРРИДА Голос и феномен и другие работы по теории знака Гуссерля Presses Universitaires de France, Paris 1967...»

«Вступительное слово академика РАН А.С. Бугаева. 13 Предисловие Часть I. Видеоинформационные приложения и объем цифровой информации Введение Глава 1 Форматы изображений. Статические и динамические эталонные изображения 1.1. Аналоговые и цифровые растровые изображения 1....»

«Этот лист безопасности подготовлен добровольно: это не требуется в соответствии со Статьей 31 Правил ЕЭС №1907/2006 (REACH), Прил.II. ПАСПОРТ БЕЗОПАСНОСТИ CETOL WF 791 BASE TC РАЗДЕЛ 1: Идентификация вещества/препарата и компании/ предпринимателя.1.1 Идентифи...»

«НАРОДНЫЙ КОНТРОЛЬ ЗА РАБОТОЙ УПРАВЛЯЮЩИХ КОМПАНИЙ КОМИССИЯ ПО ЖКХ ЧТО НУЖНО ЗНАТЬ О Рязань 2012 Уважаемые рязанцы! Сфера ЖКХ всегда вызывает наибольшие нарекания у граждан. На мой взгляд, нарекания справедливые! Проблемы десятилетиями не решались, только накапливались. Сегодня на государственном и региональном уровне п...»

«Постановление Правительства КР от 30 декабря 2008 года N 735 ПОСТАНОВЛЕНИЕ ПРАВИТЕЛЬСТВА КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ г.Бишкек, Дом Правительства, от 30 декабря 2008 года N 735 О мерах по реализации требований статей 98, 242,...»

«БИБЛИОГРАФИЯ 355 в центрально-симметричном поле получено разностное уравнение для конечных сферических функций. Далее строятся и решаются разностные уравнения Клейна — Гордона и Дирака. Вопрос о сходимости полученных решений связан с вопросом о размерах облас...»

«УДК 612.581.1:633.1 В. А. ВАХНЕНКО, Б. А. КУРЧИЙ РЕЗОНАНСНАЯ МОДЕЛЬ ПОЛЕГАНИЯ ЗЛАКОВ Предложена модель для описания устойчивости к излому растений с цилиндрическим строением стебля (ржи, пшеницы и ячменя). Определяю...»

«Iconbit pride обзор инструкция 2-04-2016 1 Островной по-рабочему не набивает по-норвежски пропадавшими приплодами. Однофазная непротиворечивость, но не наперво не продавленная деталь является укрывавшимся пеленгом, а нехарактерные или боязно включаемые футу...»

«А.Н. Воробьев ЛЕВИАФАН ПОНЕВОЛЕ: ЗАХВАТ ГОСУДАРСТВА КАК СЛЕДСТВИЕ РЕЖИМНЫХ ДЕФОРМАЦИЙ Препринт WP14/2012/07 Серия WP14 Политическая теория и политический анализ Москва УДК 32.01 ББК 66.0 В75 Редактор серии WP14 "По...»

«625035, г. Тюмень, ул. Республики, 160. Тел. (3452) 32-08-56, факс 32-11-22. Е-mail: aekolog@rambler.ru Исх. № 6 16 февраля 2016 г. Главе Администрации города Тюмени А.В. Моору Уважаемый Александр Викторович! В целях реализации положений Лесного кодекса РФ в 2004 году...»

«Бочарникова Екатерина Алексеевна О СООТНОШЕНИИ ПОНЯТИЙ ТЕКСТ И ДИСКУРС В ЛИНГВИСТИКЕ В статье описываются некоторые проблемы интерпретации понятий текст и дискурс в современной лингвистике. Кратко п...»

«Утарбаева Регина Салимзановна ИСТОКИ ДОБРА И ЗЛА В БАШКИРСКОМ НАРОДНОМ ЭПОСЕ УРАЛ БАТЫР Статья раскрывает философские аспекты эпоса Урал батыр, являющегося источником для изучения...»

«УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА Том 149, кн. 5 Гуманитарные науки 2007 УДК 02.11.91 ОТКРЫТОСТЬ ДРУГОМУ: ОПЫТ ВВЕДЕНИЯ В ФЕНОМЕНОЛОГИЧЕСКУЮ ЭТИКУ Э. ЛЕВИНАСА (НЕ БЕЗ ПОМОЩ...»

«Запобігання та ліквідація надзвичайних ситуацій УДК 004.384:654.924.5 В.Н. Рудницкий, Н.В. Хрулев, Ю.Ф. Ерофеев Черкасский государственный технологический университет, Черкассы КЛАССИФИКАЦИЯ ФУНКЦИЙ КОМПЬЮТЕРИЗОВАННОЙ СИСТЕМЫ ПОЖАРНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ Рассмотрены вопросы систематизации функций компьютеризованных систем пожарной сигнализации. Предлож...»

«ЖАНРОВАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПРЕСС-РЕЛИЗОВ © Белошапкин А.Н. Хакасский государственный университет им. Н.Ф Катанова, г. Абакан Изменения, происходящие в русском литературном языке, вызванные его демократизацией, привели к тому, что публицистический стиль сегодня активизировал т...»

«Галина Кизима Консервирование и домашние заготовки Легко и вкусно! Издательство АСТ Москва УДК 641 ББК 36.997 К38 Кизима, Галина Александровна Консервирование и домашние заготовки: легко и вкусно К38 / Г. Кизима. — Москва : Издательство АСТ, 2015. — 288 с. — (Самая н...»

«KMX50 series RU Основные узлы и детали кухонного комбайна Kenwood Перед использованием электроприбора Kenwood Внимательно прочтите и сохраните эту инструкцию. Распакуйте изделие и снимите все упаковочные ярлыки. Меры предосторожности Перед поднятием или снятием инструментов/насадок,...»

«ОСОБЕННОСТИ 1. горизонтальное разрешение 600 ТВ линий ЦВЕТНАЯ ВСЕПОГОДНАЯ КАМЕРА ВИДЕОНАБЛЮДЕНИЯ Четкое и качественное изображение достигнуто благодаря использованию Sony CCD матрицы с 410.000 эффективных пикселей, что дает горизонтальное разрешение 550 ТВ линий.2. день/ночь Камера имеет функцию автоматического опр...»

«Книги, выпущенные при поддержке Российского гуманитарного научного фонда (РГНФ http://www.rfh.ru/index.php/ru/) Поступили в АОНБ 3 кв. 2014 года Книги адресованы исследователям, научным работникам, могут быть полезны преподавателям и студентам вузов, учащимся других учебных...»








 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.